| 研究課題/領域番号 |
19K16131
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
佐々木 桂奈江 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (80752427)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ゴルジ体 / ストレス応答 / 糖鎖修飾 / プロテオグリカン / 転写制御 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ゴルジ体でO型糖鎖修飾されるプロテオグリカン（PG）に焦点を当て、O型糖鎖修飾の能力を増強させるストレス応答機構（PG経路）を解明することを目的とし、以下の実験を行った。
PG経路の転写因子やストレスセンサーなどの制御因子を網羅的に同定するために、CRISPR-Cas9システムにより作製したヒトの全遺伝子ノックアウト細胞群を用いた網羅的スクリーニングを行う予定である。PG経路の転写制御配列PGSEの下流にコレラ毒素（DT-A）をコードする遺伝子をつないだコンストラクトを、網羅的ノックアウト細胞に導入し、PG経路特異的なゴルジ体ストレスを誘導する。PGSEの転写誘導が起こる細胞は死ぬが、PG経路が阻害されてPGSEの転写誘導が起こらない細胞は生き残ることを利用して、ゴルジ体ストレス耐性細胞群における濃縮された遺伝子ノックアウト領域を特定することにより、PG経路の制御因子を特定する。
本年度はその準備としてPGSE-DT-Aを作製したが、DT-A mRNAの転写効率が悪く、効率的な細胞死が誘導されなかった。現在、転写効率を改善するためにPGSEを含む配列やmRNAの転写や安定性、翻訳効率に寄与するプラスミド配列の改変を行なっている。さらに、DT-Aの代わりにEGFPを用いてFACSでスクリーニングを行う準備も行なっている。この方法を用いるとより感度の高いスクリーニングを期待できる。
またin silicoスクリーニングにより、転写因子候補としてKLFファミリーに属する複数の転写因子を解析中である。過剰発現系においてPGSEの転写活性が上昇すること、PG経路特異的なゴルジ体ストレス条件下においてその転写因子群のmRNA量、タンパク質量がともに増加することが明らかとなった。現在、KO細胞を作製し、解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CRISPR-Cas9システムにより作製した、ヒトの全遺伝子ノックアウト細胞群を用いた網羅的スクリーニングの進捗状況については、まだ、PG経路の転写制御配列PGSEの転写活性をモニターするコンストラクト（PGSE-DT-A）の完成に至っておらず、やや遅れている。しかし、バックグラウンドが低い、かつゴルジ体ストレスに対して感度の高いコンストラクトを作製することが、網羅的スクリーニングの成功に不可欠であるため、この工程についてはある程度の時間がかかることを覚悟している。
またin silicoスクリーニングについては、得られた転写因子候補がPG経路に関与する結果が得られつつある。PG経路の転写因子を同定できれば、PG経路の制御機構解明に向けてさらに加速することができるため、本年度全体の研究の進捗状況としては順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の推進方策としては、CRISPR-Cas9システムによる網羅的スクリーニングとin silicoスクリーニングによって抽出された転写因子候補の解析を同時進行することで、さらなる進捗を図る。
特にCRISPR-Cas9システムによる網羅的スクリーニングでは、DT-Aによる細胞死でスクリーニングを行う方法の他にEGFPの蛍光によりFACSでスクリーニングを行う方法の準備も進めており、前者の方法で制御因子候補が得られなかった場合に備えている。
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