| 研究課題/領域番号 |
19K16649
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| 研究機関 | 岐阜薬科大学 |
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研究代表者 |
高橋 圭太 岐阜薬科大学, 薬学部, 講師 (50634929)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 経口ワクチン / DNAワクチン / 乳酸菌ベクター / Citrobacter rodentium |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、乳酸菌をベクターとして用いる新規経口ワクチンプラットフォームに関する研究である。R2年度は、(1)-(3)の項目を実施した。(1)抗原発現乳酸菌による免疫：昨年度までにLactococcus lactis NZ9000株 (LL)を基に構築した抗原発現遺伝子組換え乳酸菌の経口投与での特異免疫誘導能をマウスで評価したが、この免疫誘導能は低レベルだった。LLの腸管内滞留時間が短いこと、あるいはアジュバント活性が弱いことが低レベルの免疫誘導能の原因と考えられた。R2年度は免疫誘導能の高い乳酸菌種のスクリーニングを行うため、複数のLactobacillus属細菌で抗原蛋白の発現が可能な大腸菌-乳酸菌シャトルベクターを構築し、Lactobacillus属細菌での抗原発現系を構築した。(2)細菌様粒子(BLP)と抗原の複合体を用いた免疫：LLの酸処理により細胞壁成分のみからなるBLPを調製できる。本研究では、大腸菌発現系で作製したTir (Citrobacter rodentium由来)をモデル抗原としてBLPに結合させ、マウスに経口投与し抗原特異的免疫誘導を評価した。抗原結合BLPの経口投与では、特異的IgG抗体価の上昇は認められるものの、粘膜IgA抗体価の上昇は認められなかった。腸管での抗原の保護および滞留性の向上を目的としたBLPのキトサンコーティングは、抗原結合BLPの投与により誘導される抗体産生に影響しなかった。(3)DNAワクチン送達系：真核細胞用発現プラスミドを保持するLLの経口投与により、主に小腸粘膜固有層に局在する好酸球で発現プラスミド由来の遺伝子発現が起こることを明らかにしてきた。R2年度は、モデル抗原として卵白アルブミン(OVA)を用い、乳酸菌の経口投与によりOVA特異的免疫誘導が起こるかを解析したが、特異免疫の誘導はみられなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
抗原遺伝子を導入した抗原発現乳酸菌（抗原発現系）、および真核細胞用発現プラスミドを保持する乳酸菌（DNAワクチン系）について、免疫誘導能が低いことが明らかになった。より強い免疫誘導能を示す可能性のあるLactobacillus属乳酸菌のスクリーニングを行うため、ベクター（プラスミド）の構築、遺伝子導入、抗原蛋白発現条件の確立を試みているが、個々の菌種での最適化に時間を要している。また、乳酸菌から調製した細菌様粒子 (Bacterium-like particles, BLP)と抗原の複合体を用いた免疫については、粘膜免疫の指標である糞便中IgA抗体価の上昇がほとんどみられなかったため、その原因の究明と改善方法の検討を進めている。そのため、当初予定していた病原体の攻撃感染に対する防御効果の検証が実施できていない。これらのことから、現在までの進捗状況としては「やや遅れている」と考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究成果を踏まえ、(1)-(3)の項目について、今後は以下に記載した内容で研究を進める。
(1) Lactobacillus属の複数の乳酸菌種の免疫誘導能をスクリーニングし、免疫誘導に適した乳酸菌の同定を行う。さらに、Lactococcus lactis（LL）の免疫誘導の向上のため、Lactobacillus rhamnosus GG株の腸管滞留性に寄与していることが知られているSpaCBA線毛オペロンを乳酸菌発現ベクターにクローニングし、さらにSpaCの一部を抗原蛋白遺伝子に置き換えたものをLLに導入し発現させる。
(2) BLP抗原複合体を用いた免疫誘導：抗原結合BLPの経口投与で粘膜IgA抗体産生が誘導されない原因を明らかにするため、抗原結合BLPの経口投与後の腸管関連リンパ組織（パイエル板および腸間膜リンパ節）での免疫応答（抗原提示、樹状細胞の活性化、遺伝子発現パターン解析等）を解析する。また、粘膜アジュバントとして機能する可能性のある鞭毛構成蛋白FliC (Salmonella enterica 由来)、あるいは大腸菌一型線毛蛋白質FimHを抗原と共にBLPに結合させ、BLPの粘膜免疫誘導能に及ぼすFliC、FimHの影響を検討する。
(3) DNAワクチン送達系：これまで使用してきたLactococcus lactis NZ9000株に加えて、複数のLactobacillus属菌種の乳酸菌の免疫誘導能をスクリーニングし、免疫誘導に適した乳酸菌の同定を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進捗がやや遅れており、予定していた実験（動物を用いた感染実験）の一部を行えなかったため、当該実験に必要な費用を次年度に繰り越した。
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