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本研究開発提案では、独自に樹立した高感度・高精度のmRNA 監視機構（Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)）評価システムについて、改良を行い、新規化合物、細胞ストレスのスクリーニング バリデーションを行った。同時に、得られたリード化合物による希少遺伝性疾患治療のin vitro レベルでのPOC(概念実証)を取得し、開発を加速させるものであった。
1)NMD活性ハイスループットスクリーニングレポーターシステム樹立について、昨年度作成したHibit-GFP型のNMD感受性レポーターベクターを発現するレンチウイルスの作成を実施した。また、CRISPR-CAS9 systemを用いたスクリーニングシステムについて導入を進めた。さらに、昨年度までに作成したレポーター細胞を用い、NMDを抑制するストレス刺激を同定した。
2) CFTR W1278X ノックインマウスについて、表現型が生後6~9週での致死であることを確認した。本年度は、CFTR W1278Xヘテロマウスを維持し、自然交配により実 に必要なホモ個体匹 を確保を目指した。しかし、子食いにより個体が得られず、十分な個体が得られなかった。ホモ個体が得られない中、研究を進展させるため、培養細胞を用いたCFTR機能評系の構築を行うことを決定し、Flp-In systemのヒトCFTR野生型とW1282X ベクターを構築した。これに、イントロンを加えることで、NMD感受性の 異CFTR発現ベクターとした。
個体レベルの解析について、１）で同定したストレスによるNMD抑制について、マウスへの薬剤投与後、肝臓・腎臓よりRNAを抽出し、RT-qPCRにより、NMD標的RNAの蓄積を確認した。
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