本研究は、生きているヒナ大脳で神経軸索ガイダンス因子の発現と機能を解析し、刻印付けに伴って神経回路が改編される分子メカニズムを解明することを目的としている。今年度は、刻印付け依存にNetrin-1遺伝子の発現上昇が見られた領域の組織学的解析を行った。また、大脳において内在性の遺伝子発現を抑圧したニワトリヒナ個体の作出を試みた。 ニワトリヒナに対して1時間の刻印付けトレーニングを2回行った後、Netrin-1の遣伝子発現変化をin situ hybridization法により解析した。その結果、昨年度に報告したhyperpallium内でNetrin-1遺伝子が刻印付けに伴って上昇するのは、intermediate medial hyperpallium apicale(IMHA)と呼ばれる限局された領域であった。さらにIMHAの神経細胞をイボテン酸により活動停止させたヒナ個体で刻印付けが成立しないことも明らかとなり、IMHAが刻印付けの成立過程に必須な大脳領域であることが示された。 Netrin-1とEphrin-B2の遺伝子発現改変個体の作出に関しては、大脳のIMM領域に内在的に発現している遺伝子の発現を抑圧できるかどうか検討した。方法は、過去に行った発現解析によって刻印付けに関連することを示した、微小管結合タンパク質(MAP2)遺伝子を標的としたmicroRNA発現ベクターを作成し、左右脳半球のIMM領域に導入した。その結果、このベクターが導入された神経細胞で、内在性のMAP2タンパク質が減少した。さらに、このMAP2遺伝子発現が抑圧された個体では刻印付けが成立しなかったことから、MAP2が刻印付けに必須なことだけでなく、遺伝子発現と刻印付け行動の相関性を解析するにあたって、このmicroRNA発現系が応用可能であることを示している。
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