| 研究課題/領域番号 |
20H00411
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
朴 龍洙 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 教授 (90238246)
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| 研究分担者 |
加藤 竜也 静岡大学, 農学部, 教授 (00397366)
宮崎 剛亜 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 助教 (30775721)
鈴木 亮介 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (50342902)
筏井 宏実 北里大学, 獣医学部, 准教授 (80327460)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ウイルス様粒子 / 抗原提示 / エンベロープ / デングウイルス / 磁性ナノ粒子 / タンパク質精製 / マラリア抗原 |
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| 研究実績の概要 |
(1)SC/ST化学修飾による多価VLPの作製：ノロウイルス様粒子（NoV-LP）にSpyTag (ST)を融合したNoV-LP、SpyCatcher (SC)にEGFPを融合したSC-EGFP及びm-Cherryを融合したSC-Cherryを共発現したところ、EGFPとm-Cherryを提示したNoV-LPの形成を確認した。Merozoite surface proteinとCircumsporozoite protein抗原CSPΔTM、MSPΔTM及びpfMSP1-19をカイコで発現し得られたタンパク質をそれぞれ1.5 mg, 2.5 mg, 1.8 mg及び1.8 mgを得、動物試験に供した。
(2）ナノ粒子の機能化：Flagタグを連結した4価DENV-LPをカイコで発現し、Flagタグを修飾した磁気ナノ粒子（MNP）で精製したところ、DENV-LP/CprMEは、カイコ１頭当たり43 μg、prMEの場合10 μgの精製タンパク質（回収率69ー79％）を回収した。
(3) 動物実験：カイコで発現・精製したDENV-LP/1-4CprME及びDENV-LP/1-4prMEを、２週間間隔で2回マウスに免疫を行った。DENV-LP/CPrMEがDENV-LP/prMEよりも強い免疫応答を示し、最も高い活中和活性を示した。
マラリアの抗原CSPΔTM、MSPΔTM及びpfMSP1-19を2週間間隔2回マウスに免疫を行い、免疫63日後Plasmodiuim yoelli XL原虫を攻撃し、血清の赤血球内寄生生殖変化（parasitemia）を調べたところ、抗体は産生したものの、パラシテミアの値は対照実験と大きな差はなかった。この結果は、P. yoelliは本抗原の評価系としては不適切であると判断し、今後P. yoelli評価系に適した抗原を用いる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今回カイコで発現したマラリア抗原を、Plasmodiuim yoelli 評価系で評価を試みたが、評価系として不適切であったため、Plasmodiuim yoelli 評価系に適切なマラリア抗原の発現を行っている関係で、やや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 抗原提示用抗原の最適化：デングウイルス抗原として血清型1-4の4種類のEタンパク質をデングウイルス様粒子（DENV-LP）の表面提示を計画したが、タンパク質の大きさ（約45 kDa）が大きく、VLPへの提示効率が悪かった。この問題を改善するために、Eタンパク質のエピトープを含む小型のドメインをスクリーニングし、VLPへの提示を最適化する。VLPのプラットフォームとして血清型2CprMEタンパク質を用いる。マラリアの抗原提示の場合、Plasmodiuim yoelli評価系に適した抗原を3つの感染ステージから3種類ずつ選び、大腸菌で発現する。動物実験後抗原性が高い抗原3つをNoV-LPの表面に提示する。
(2）動物実験用サンプルの作製及び：既に作成済みのプロトコールに従って、DENVのEタンパク質の小型ドメイン候補タンパク質をマウスに免役し、抗原としての評価を行う。マラリアの抗原については3つの感染ステージから合計9タンパク質を選び、発現したタンパク質を前年度確立したプロトコールに従って動物実験に供する。
(3) 動物実験後のサンプルの解析：デングウイルス抗原については、等温滴定熱量測定（ITC）によるヘパリンとの結合活性、抗体産生及び中和活性を調べ、最適な抗原候補を決定する。マラリア抗原については、抗体の産生やP. yoelli攻撃後採収した血清の赤血球内寄生生殖変化（parasitemia）を調べ、抗原提示用抗原を選定する。
【研究代表者と研究分担者の役割】分担者加藤は抗原の発現、分担者宮崎はデングウイルス抗原の最適化、分担者鈴木はデングウイルス抗原の評価、分担者筏井はマラリア抗原の評価を担当し、研究代表者は動物実験用抗原を作製し、研究を総括する。
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