| 研究課題/領域番号 |
20H03262
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
黒木 俊介 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (50735793)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | エピゲノム |
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| 研究実績の概要 |
ほ乳類の性はY染色体上の性決定遺伝子Sryの発現の有無によって決まる。近年、Sry発現にエピゲノムの制御が重要であることが明らかになってきた。ヒストンH3の9番目リジン（H3K9）のメチル化は転写抑制のエピゲノムマークである。H3K9脱メチル化酵素のひとつJmjd1aは、Sry遺伝子座に作用してH3K9のメチル化を外し、Sryの転写活性化を促す。しかし、Jmjd1aがどうやってSry遺伝子座を認識しているのか、その機構は分かっていない。本研究では、Biotin化酵素 (TbID) による近依存性標識法を用いて、生殖腺におけるJmjd1aとの相互作用タンパク質を同定し、Jmjd1aがSry遺伝子を特異的に標的とするメカニズムの解明を目指す。
今年度は、Jmjd1a遺伝子座にTbIDを融合したノックインマウスを樹立し、系統化した。
ノックインマウスの胎仔期生殖線の組織免疫染色の結果から、Jmjd1a-TbIDの発現パターンが野生型Jmjd1と同様であること、Jmjd1a-TbIDがSryの発現に影響を与えないことを確認した。平行してin vivo Biotinラベリングの条件を検討し、胎児生殖線のJmjd1a-TbID発現細胞の核にビオチン化のシグナルを認めるBitonの投与条件を決定した。平行してJmjd1a-TbIDノックインマウスからES細胞を樹立した。この細胞を用いて近依存性Biotin標識法を用いた質量分析がワークするか否か予備実験を行った結果、この系でJmjd1aと相互作用するタンパク質の候補を得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
近依存性標識に用いるJmjd1a遺伝子座にTbIDを融合したノックインマウスの系統樹立を完了した。TbIDによるBiotin標識のin vivoラベリングの投与条件を決定した。Jmjd1a-TbIDノックインES細胞を樹立し、この細胞を用いて質量分析によりJmjd1aと相互作用するタンパク質の候補を同定できることを確認した。したがって、生殖腺体細胞におけるJmjd1a相互作用タンパク質の網羅的同定への準備はほぼ整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
近依存性標識法によりBaitの相互作用タンパク質を同定する際に、baitのspatial referenceがあることが望ましい。そこでJmjd1a-TbID遺伝子座のJmjd1a CDS末端に2A-peptideかつTbIDにNLS配列を挿入したノックインマウスをCRISPR/Cas9ゲノム編集により樹立する。TbIDによるビオチン化を誘導した胎生11.5日胚から生殖腺を摘出プールし、Jmjd1a-TbID融合タンパク質と相互作用するタンパク質を質量分析に同定する。得られたJmjd1a相互作用タンパク質の情報を、申請者が既に取得している胎生11.5日生殖腺の遺伝子発現リストと照合し、生殖腺に特徴的な発現を示す遺伝子と一致した場合、それらをReader/Recruiter候補分子としてリストアップする。特に、Reader候補としてヒストン結合能をもつクロマチン因子、Recruiter候補として転写因子に注目する。
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