| 研究実績の概要 |
本研究では, インテグリン (ITG)を含む小胞の生成・輸送機構に注目し,その制御因子群が形質膜輸送を介して接着のアヴィディティの調整に寄与するのか, または排出経路を介してEVsの放出に寄与するのかを明らかにし, EVs放出―形質膜輸送経路のバランスの維持機構とその破綻の機能的帰結を解明することを目的とする. そこで2020年度はその達成のための実験系の確立を進めた.
Nano-LCシステムとMALDI-TOF/TOF質量分析計を用いて, ペプチド混合物を疎水性カラムで分離・スポット・結晶化しMS, MS/MS測定を自動的に行う実験系を確立し, 得られたデータをProteinPilotソフトウェアで解析することによりペプチド配列を含むタンパク質を網羅的に同定するストリームラインの構築に成功した. この系と大腸菌由来コントロールペプチドライブラリーを用いて解析を行ったところ約150種類のタンパク質が同定されることを確認した. ITG相互作用因子群の同定にこの系を応用する目的で, タグ化したITGを排他的に発現するリンパ球株を樹立し, 細胞接着能が保持されていることを確認した. 抗タグ抗体を用いた免疫沈降によりITG複合体を精製しトリプシンによる酵素消化後, 上述のNano-LC, MALDI-TOF/TOF, ProteinPilotの系を用いて測定・解析を行ったところ, 既知の相互作用因子を含む約100種類のタンパク質の同定に成功した. 今後この系と, 確立中である小胞を精製する実験系を組み合わせることによりITG小胞特異的因子の同定を進める.
またITG含小胞の可視化に関して, 蛍光標識化ITGと超解像スピニングディスク型共焦点顕微鏡Dragonflyを用いて細胞内ITG小胞の高い空間分解能での可視化に成功した. 現在長期ライブイメージングを達成するための条件検討を進めている.
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| 今後の研究の推進方策 |
今後, 上記で確立した質量分析を用いた実験系をITG小胞含有因子の解析に応用するために, 細胞内小胞/細胞外小胞の単離法の確立を目指して種々の実験を計画している.
細胞内小胞に関してはスピンカラムを用いた種々の小胞単離法を検討し,小胞画分の種々のマーカーを用いて精製度を比較検討しながら進める. 細胞外小胞に関しては特異的マーカー分子であるPhosphatidylserinと金属イオン依存的に特異的に結合するTim4を結合させたビーズを用いて精製する. この系を用いてテトラスパニン等の既知のマーカー陽性の細胞外小胞が得られることはリンパ球株を用いた実験から確認しており, 本研究で樹立した細胞に使用可能かを検証する段階にある.
また, ITG小胞の長期ライブイメージングについては光安定性の高い蛍光物質を導入し, 低い照射出力で十分な輝度の得られる条件を検討することで改善を進める.
加えて, 今回超解像イメージングを用いて明確に可視化できたITG小胞に対して, 種々の小胞輸送関連因子の抗体を用いて染色することでITG小胞の実体を既存の小胞輸送制御機構の観点からも特徴づけることを目指す.
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