| 研究課題/領域番号 |
20K07378
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
土橋 洋 国際医療福祉大学, 国際医療福祉大学病院, 教授 (90231456)
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| 研究分担者 |
北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
坪地 宏嘉 自治医科大学, 医学部, 教授 (50406055)
野村 幸世 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (70301819)
後藤 明輝 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (90317090)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Trefoil factor / 肺癌 / バイオマーカー / mTOR / 転写制御 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト肺癌でmTORにより発現抑制される新規分子としてmicroarrayからTrefoil factor-1 (TFF1)を抽出した。これまでの基盤研究で、i) mTOR抑制剤によるTFF1 promoter活性の上昇、ii) TFF1の腺癌細胞特異的な発現、iii) 肺癌患者における血清TFF-2の高値、を得た。本年度は培養細胞でTFFの発現機序を、肺癌組織で発現動態を解析した。[方法]1. TemsirolimusによるmTORの抑制でTFF2,3の動態変化もELISAで解析した。 2. その際に変動するTFF1の転写因子をELISAで検索した。 3. 患者血清、尿のTFF1-3レベルと肺癌組織における免疫組織化学的発現を比較検討した。[結果]1.細胞株でのmTOR抑制でTFF1の発現亢進が見られたのは腺癌のみで、内因性発現の無い細胞には薬剤刺激後も発現は認めなかった。TFF3も同調的変化を示したが、TFF2は減弱した。2. mTOR抑制によるTFF1 promoter活性の上昇の際、転写因子GATA3、HNF-3、Estrogen receptor （ER）は有意な変動を認めなかった。 3．TFF1による細胞増殖抑制、細胞死の亢進を明らかにしたが、TFF1過剰発現株ではGATA3、HNF-3のいずれも活性が低下し、TFF1によるnegative feedbackが予想された。4. 免疫染色ではTFF1-3は全組織型の肺癌組織で発現を認め、TFF1,3は血清レベルと相関したが、TFF2は逆相関した。 [結論] TFF1のmTORによる転写レベルでの発現抑制の介在転写因子はGATA3、HNF-3、ER以外であり、feedback機構も考えられる。TFFは肺癌のバイオマーカーとなる可能性があるが、TFF1-3のredundancy等の制御機構も予想された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々が見出した、mTORの発現により変動する蛋白質であるTFF-1とそのファミリーに関してヒト肺癌と培養細胞の両系でその機能とバイオマーカーとしての有用性を解析するのが本研究の目的である。その観点から、
1. 肺癌培養細胞における解析はTFF-1過剰発現株や種々の手法で発現、転写の解析が進み良好な結果を得た。mTORによる制御系の責任転写因子が同定できず、これを次年度の最重要課題とする。
2. 蛋白発現解析で、肺癌細胞からのTFFsの発現、分泌を確認したが、TFF1では培養細胞(腺癌のみで発現)とヒト肺癌手術材料(全ての組織型で)との不一致も明らかとなった。また血清、尿中レベルとも密接に関わると推定される細胞外分泌機序の更に詳細な解析が必要である。
3. 肺癌、非腫瘍性肺疾患患者、健常者の血清、尿のTFFs定量は検体採取、解析ともに順調な進捗状況で、論文化できるデータがそろった。また、術後患者のTFFの定量も経時的に開始したが、これに関しては症例数がまだ少なく、統計解析するレベルに達するような数を集めるために倫理申請も追加した。
4. 3.の患者の手術材料のTFF1-3に関する免疫染色、その結果の画像解析を用いた定量化も終了し、順調な進捗状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. TFF-1の転写制御解析は候補因子が多数あるが、蛍光抗体法染色、ELISAによる解析でGATA3、HNF-3、Estrogen receptorの関与は否定的であった。HNF-4, c/EBP, GATA6に関してもその発現、活性解析用の免疫蛍光染色を行っているが、更にELISAキットを購入したのでそれらで解析する。
2. TFF-1の発現は培養細胞では腺癌のみであったが、ヒト肺癌手術材料では全ての組織型で確認した。つまり不死化細胞株の樹立にはTFF-1が抑制的機能を有し、腺癌では抑制を回避する機序が存在すると考えられる。この機序の一端としてKRAS、NKX2-1等の関与を念頭に遺伝子変化の解析を進める。
3. 肺癌とTFFsの直接的関係を確認するために、術後1, 3, 6, 12か月の定期検査時に採取しているが、症例数がまだ少なく、統計解析するレベルに達していないので、引き続きこの検体採取を進める。
4. 患者手術材料のTFF1-3に関する免疫染色は終了した。TFF2は血清、尿中での動態と必ずしも相関しないので、TFF1-3間相互の拮抗性も含めて詳細な統計解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
1. 前年度までの基盤研究中に、術後患者の検体も定期検査時に採取して、アッセイする計画を追加した。術後12か月まで継続しているが、経過中に化学療法の対象となったり、他病院に紹介となる症例も存在し、解析検体数が十分に確保できなかった。これについては引き続き計画を継続するが、現有の機器、試薬でほぼ行えるので高額な消耗品費は必要としない。
2. mTORによるTFF-1の発現制御における転写因子を複数解析中だが、使用していた、あるいは使用予定であった特異抗体、ELISA kit等がコロナの影響もあり、生産中止、あるいは中断になり解析が遅れた。徐々に生産が再開され、また他の代替抗体、kitも購入したので解析を再開している。またELISA以外に、転写因子の活性化(リン酸化)を各蛋白質のリン酸化型特異抗体を用いた免疫蛍光染色、immunoblottingで解析する戦略も追加した。主としてkit, 特異抗体の購入のために繰越研究費の相当額を充てる予定である。
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