| 研究課題/領域番号 |
20K09914
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
中島 和久 鶴見大学, 歯学部, 講師 (90252692)
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| 研究分担者 |
二藤 彰 鶴見大学, 歯学部, 教授 (00240747)
出野 尚 鶴見大学, 歯学部, 助教 (40435699)
小松 浩一郎 鶴見大学, 歯学部, 准教授 (60153665)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 細胞分化 / 破骨細胞 / ウイルス感染 |
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| 研究実績の概要 |
破骨細胞は血球系の単球・マクロファージ系の細胞に由来する多核細胞で、特徴的な形態と機能を発揮する細胞群である。この細胞の機能解析には各種ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法が用いられてきたが、細胞の機能へのウイルスベクター感染自体とcDNA過剰発現の効果については定かではない。
我々は、培養マウス骨髄細胞の破骨細胞への分化の過程で、アデノウイルスベクターによりcDNAを発現するとTRAP陽性細胞の出現は認められるものの、その融合が極めて抑制されて、多核破骨細胞の形成が低下することを見出した。この抑制はcDNAを含まないベクターでは認められないが、ベクターの発現カセットに導入されたcDNA配列には非依存的であり、GFP、beta-galactosidase、CreリコンビナーゼのいずれのcDNAも抑制した。従って、この抑制作用は転写と翻訳に依存することが予想できる。
ウイルス感染では、サイトカインの１つinterferon betaは破骨細胞形成に抑制的であることが報告されている。ウイルスベクター感染による破骨細胞形成の抑制がサイトカイン合成を経由するのか、感染細胞内での転写と翻訳に依存するのかを区別するために、シグナル強度の高いCOP-GFPを感染させた。するとGFP陽性細胞にのみ破骨細胞形成の抑制が現れた。従って、ウイルスベクター感染による破骨細胞形成の抑制は感染細胞内での転写と翻訳に依存すると考えられる。以上の現象は血球系細胞に特異的かを問うために、マウス筋芽細胞株にウイルスベクターを感染させると、マウス筋芽細胞株の細胞融合を阻害した。本内容の一部は第44回日本分子生物学会年会で発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１）アデノウイルスベクターによる導入遺伝子の発現パターンと細胞融合の経時的解析
マウス骨髄細胞にへの導入効率をウイルス表面抗原に対する抗体での免疫染色法にて標準化した。その結果、cDNAを含むウイルスと含まないウイルスで感染効率に大きな差はないものの、表現型の再現性が得られた。遺伝子配列に対応して標準化する方法を構築中である。
２）ウイルス感染ではサイトカインの産生を介してcell non-autonomousに細胞分化を抑制する可能性がある。細胞分化抑制作用が感染細胞内での転写と翻訳に依存するのかを区別するために、シグナル強度の高いCOP-GFPを感染させた。するとGFP陽性細胞にのみ破骨細胞形成の抑制が現れた。この抑制は破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化の進行に依存しており、RANKL刺激の24時間後には、GFP陽性細胞も破骨細胞を形成した。ウイルスベクター感染による破骨細胞形成の抑制は感染細胞内での転写と翻訳に依存すると考えられるので、翻訳量の変動を測定する手法を導入中である。
３）破骨細胞分化における細胞内RNAセンサー分子群の役割を追求する。破骨細胞分化に伴う細胞内RNAセンサー分子の発現量の変化を検討したところ、RANKL刺激での発現量変動は認められなかったが、ウイルス感染により発現量が変動した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）アデノウイルスベクターの導入効率を標準化するために、ベクター由来va1遺伝子の発現レベルにて標準化する。ベクター間での基本骨格が異なるため、遺伝子配列に対応して標準化する方法を構築中である。
２）ウイルスベクター感染による破骨細胞形成の抑制は感染細胞内での転写あるいは翻訳に依存すると考えられる。アデノウイルスベクターによる遺伝子導入に対する細胞応答を転写に依存する反応と翻訳に依存する反応に区別して観察するために、Tet-ONシステムを利用した破骨細胞株を樹立する。
3) 細胞分化における細胞内RNAセンサー分子群の役割を追求する。
アデノウイルスベクター感染前に、RIG-I、MDA5に対するsiRNAを導入して各分子を特異的に阻害したのちに、アデノウイルスベクターを感染させて、筋芽細胞分化と破骨細胞分化にどちらが優位に機能しているか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
学会参加のため旅費を計上したが、学会のいくつかがオンラインでの開催となったため。
又、細胞生物学的研究と分子生物学的研究を優先させたため。 差額分は、ベクター構築と遺伝子発現量の解析に必要な消耗品と動物実験のためのマウスの購入に充てる予定である。
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