2020 年度実施状況報告書

化学療法剤超感受性を付与する高度なゲノム恒常性維持機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	20K09915
研究機関	福岡歯科大学
研究代表者	日高真純福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (80238310)
研究分担者	藤兼亮輔福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (20581713)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	DNA損傷応答 / 細胞周期チェックポイント / アポトーシス / ATR/CHK1 / 化学療法剤
研究実績の概要	多くの抗がん剤はDNAを損傷し、増殖の盛んな細胞に対して複製ストレスを与えるが、応答するしくみは細胞の種類によって異なっている。がん細胞やそれが由来する体細胞はDNA損傷に応答して細胞周期を停止し傷の修復を試みるが、修復がうまくいかない場合は突然変異や染色体異常を伴う。一方、多能性幹細胞はDNA損傷に対して高度に感受性で、僅かなストレスを受けた場合でも修復することはせずに優先的に細胞死を選択することで高度なゲノム恒常性を維持している。そこで本研究は、細胞がストレスに応答して生死を決定する分子メカニズムを明らかにすることで、多能性幹細胞が有する高度なゲノム恒常性維持機構の解明と低濃度で作用する新たな抗がん療法の開発に向けた分子基盤の確立を目的に計画されたものである。申請者はこれまでにDNA損傷が引き起こす細胞死誘導において、クロマチン動態と損傷応答シグナリングのトランスアクションが重要であるとの知見を得てきた。そこで令和２年度は、チェックポイントの活性化において重要であることが知られているATR/CHK1のリン酸化とがん細胞の抗がん剤抵抗性の関係について解析を行った。その結果、ATR阻害剤あるいはTopBP1遺伝子ノックダウンによりATR/CHK1シグナリング経路を阻害した細胞においては、抗がん剤（シスプラチン）に対する感受性が亢進することを明らかにした。これによって、多能性幹細胞に見られる複製ストレス応答時のチックポイント活性化の回避がその優先的な細胞死選択の要因であることが強く示唆された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由申請者はヒトiPS細胞において、DNA損傷後もチェックポイントキナーゼATR/CHK1はリン酸化されず、高感度に細胞死が誘導されることを検証してきた。このことは、Guptaらの最近の報告（Gupta et al., PNAS, 2018）とよく一致する。そこで令和２年度には口腔扁平上皮癌細胞株SASを実験材料に用いて、ATR阻害剤（VE-821）あるいはATM阻害剤（KU-60019）で処理された細胞の抗がん剤（シスプラチン）に対する感受性を解析した。その結果、どちらの阻害剤で処理された細胞とも薬剤感受性は上昇するが、ATR阻害剤で処理された細胞においてその効果が顕著であることが明らかとなった。ATR/CHK1経路阻害の効果をより検証するために、その活性化に重要なTopBP1遺伝子のノックダウンによりATR/CHK1経路の抑制を行い同様な実験を行ったところ、TopBP1ノックダウン細胞ではシスプラチンに対する感受性が顕著に上昇することが確認できた。この時のDNAの構造変化を解析したところ、シスプラチン処理されたTopBP1ノックダウン細胞ではRPA2のリン酸化の亢進が認められ、一本鎖DNA領域が広範囲に形成されていることが示唆された。このATR/CHK1経路阻害の薬剤感受性効果は、別の抗がん剤であるアルキル化剤に対しても認められた。以上の結果は、DNA損傷応答の活性化制御が、細胞のストレス応答時の生死決定メカニズムと密接に関連していることを強く示している。これらの成果は、国際誌Oral Science Internationalに報告した（Obayashi et al., OSI, 2021）。
今後の研究の推進方策	多能性幹細胞であるヒトiPS細胞とこれまで細胞死誘導研究に利用してきたヒトがん由来培養細胞との比較を行いながら、以下の実験に取り組む。（１）がん培養細胞との比較によるヒトiPS細胞におけるチェックポイント活性化回避の検証 ATR/CHK1経路の活性化回避が細胞のストレス応答時の生死決定メカニズムと密接に関連していることを見出したので、活性化回避に伴いDNA修復が抑制されていることを検証するために、核内でのDNA損傷の蓄積を一本鎖DNAの露出や二本鎖DNA切断を指標に解析する。さらに、その時のクロマチン動態については、最近開発されたATAC（Assay for Transposase-Accessible Chromatin）法（Chen et al., Nat. Methods, 2016）を用いて、損傷領域のクロマチン動態の可視化を試みる。（２）ストレス超感受性に関連するタンパク質の網羅的な同定遺伝子ノックダウン細胞ライブラリーあるいは遺伝子ノックアウト細胞ライブラリーを構築し、その中から抗がん剤処理後にCHK1のリン酸化を誘導し薬剤耐性を獲得した細胞のスクリーニングを行う。その変異遺伝子を次世代シークエンサーによるバーコード解析にてチェックポイント回避関連遺伝子として同定する。
次年度使用額が生じた理由	当該年度がコロナ渦のため学会がすべてオンラインでの実施となったため旅費が発生しなかった。また、同様な理由で人件費・謝金も発生しなかった。これらの理由で次年度使用学が生じた。次年度には得られた成果を積極的に社会に発信していきたい。