HBV感染に対するCTLとNK細胞による免疫応答メカニズムの相違の解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K08006
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 柘植 雅貴 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 講師 (50448263)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: B型肝炎 / 免疫応答 / ヒト肝細胞キメラマウス / 抗ウイルス効果

研究実績の概要

マウス肝細胞の90%以上がヒト肝細胞に置換されたヒト肝細胞キメラマウス（以下、キメラマウス）に対し、B型肝炎ウイルス（HBV）genotype Cキャリアから採取した血清を接種し、HBV持続感染キメラマウスを作製した。非感染マウス、感染3日後、10日後、5週間後、8週後、32週後ににマウスをsacrificeし、肝組織からヒト肝細胞領域を採取。同組織のtotal RNAを抽出後、次世代シークエンス解析を実施した。
HBV感染後、マウス血中のHBV DNA量は感染6～8週目にプラトーに達することから、非感染マウスの肝組織とHBV感染8週後のマウス肝組織における遺伝子発現の相違を検討した。
これらの比較により、両マウス群間で有意に発現が変化し、かつ2倍以上の発現変化を認めた遺伝子は225遺伝子。さらに、microRNAやpseudo geneを除いた結果、196遺伝子が抽出された。そこで、これらの遺伝子情報を検索し、膜蛋白として28遺伝子、分泌蛋白として37遺伝子を抽出した。そこで、これらの発現変化について再現性を確認するため、HBV genotype Aキャリアの血清を接種し作製したキメラマウスの肝組織を用いて同様の解析を実施した。その結果、196遺伝子中132遺伝子においてHBV genotype A感染後も肝細胞内で有意な発現変化が得られた。さらに、これらの遺伝子について遺伝子情報を検索したところ、膜蛋白を14遺伝子、分泌蛋白を24遺伝子を認めた。現在、HBV genotype Aおよびgenotype C感染で共通して発現変化が認められた遺伝子を中心に解析を進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

研究実施施設の移動があったため、実験室を新たに整備する必要があったことに加え、COVID-19などの影響で、実験機器の入手に時間を要し、実験室整備が遅れ、研究進捗に影響が出た。

今後の研究の推進方策

2022年3月上旬に実験機器の搬入があり、学内での実験室登録が完了したため、組換えDNA実験計画書の承認が得られ次第、抽出した遺伝子の機能解析を開始する予定である。
HBVクローンや使用したヒト肝細胞に影響を受けない遺伝子・蛋白の同定を行うため、これまでに行った複数回の遺伝子発現解析データを統合して解析しており、次世代シークエンサ機器や解析日の相違によるデータのブレを考慮し、抽出された遺伝子に関してはreal time PCRを行い、再現性を確認する。
次世代シークエンスデータより抽出された遺伝子の中には、機能未知の遺伝子も多いため、CTLやNK細胞のHBV認識・活性化にどのように関与しているかに関する機能解析が必要となる。そこで、健常人やHBVキャリアから採取した末梢血単核球（PBMC）を用いてHBV感染細胞との反応性をin vitroにて評価する。HBV感染・非感染肝細胞の培養上清中に、検討1で抽出された分子（recombinant proteinなど）を添加したのち、PBMCと共培養し、CTL、NK細胞活性化の有無をFACSや細胞の免疫染色を用いて評価する予定である。

次年度使用額が生じた理由

研究実施施設の移動があったため、実験室を新たに整備する必要があったことに加え、COVID-19などの影響で、実験機器の入手に時間を要し、実験室整備が遅れたため。
現在、実験施設の整備がほぼ完了し、リアルタイムPCRの準備を進めており、2021年度に抽出した遺伝子に関して機能解析を実施していく予定である。

研究成果

• [国際共同研究] Loyola University Medical Center/Loyola University Chicago(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Loyola University Medical Center/Loyola University Chicago
• [国際共同研究] Universite du Quebec a Montreal(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: Universite du Quebec a Montreal
• [国際共同研究] Goethe Universitat(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Goethe Universitat
• [雑誌論文] The kinesin KIF4 mediates HBV/HDV entry through the regulation of surface NTCP localization and can be targeted by RXR agonists in vitro (2022)
  • 著者名/発表者名: Gad Sameh A.、Sugiyama Masaya、Tsuge Masataka、Wakae Kosho、Fukano Kento、Oshima Mizuki、Sureau Camille、Watanabe Noriyuki、Kato Takanobu、Murayama Asako、Li Yingfang、Shoji Ikuo、Shimotohno Kunitada、Chayama Kazuaki、Muramatsu Masamichi、Wakita Takaji、Nozaki Tomoyoshi、Aly Hussein H.
  • 雑誌名: PLOS Pathogens 巻: 18 ページ: 1009983～1009983
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1009983
  • 査読あり
• [雑誌論文] Construction of an anti-hepatitis B virus preS1 antibody and usefulness of preS1 measurement for chronic hepatitis B patients (2022)
  • 著者名/発表者名: Hatooka Haruna、Shimomura Yumi、Imamura Michio、Teraoka Yuji、Morio Kei、Fujino Hatsue、Ono Atsushi、Nakahara Takashi、Murakami Eisuke、Yamauchi Masami、Kawaoka Tomokazu、Makokha Grace Naswa、Miki Daiki、Tsuge Masataka、Hiramatsu Akira、Abe-Chayama Hiromi、Hayes C. Nelson、Aikata Hiroshi、Tanaka Shinji、Chayama Kazuaki
  • 雑誌名: Journal of Infection 巻: 84 ページ: 391～399
  • DOI: 10.1016/j.jinf.2021.12.025
  • 査読あり
• [雑誌論文] Serum miR-192-5p levels predict the efficacy of pegylated interferon therapy for chronic hepatitis B (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagura Yoshihito、Matsuura Kentaro、Iio Etsuko、Fujita Koji、Inoue Takako、Matsumoto Akihiro、Tanaka Eiji、Nishiguchi Shuhei、Kang Jong-Hon、Matsui Takeshi、Enomoto Masaru、Ikeda Hiroki、Watanabe Tsunamasa、Okuse Chiaki、Tsuge Masataka、Atsukawa Masanori、Tateyama Masakuni、Kataoka Hiromi、Tanaka Yasuhito
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 17 ページ: e0263844
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0263844
  • 査読あり
• [雑誌論文] The association between hepatocarcinogenesis and intracellular alterations due to hepatitis B virus infection (2021)
  • 著者名/発表者名: Tsuge Masataka
  • 雑誌名: Liver International 巻: 41 ページ: 2836～2848
  • DOI: 10.1111/liv.15065
  • 査読あり
• [雑誌論文] Are Humanized Mouse Models Useful for Basic Research of Hepatocarcinogenesis through Chronic Hepatitis B Virus Infection? (2021)
  • 著者名/発表者名: Tsuge Masataka
  • 雑誌名: Viruses 巻: 13 ページ: 1920～1920
  • DOI: 10.3390/v13101920
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Serum PreS1 and HBsAg ratio reflects liver fibrosis and predicts the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B patients (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishida Y、Imamura M、Teraoka Y、Morio K、Fujino H、Ono A、Nakahara T、Murakami E、Yamauchi M、Kawaoka T、Miki D、Tsuge M、Hiramatsu A、Abe‐Chayama H、Hayes CN、Aikata H、Sasaki N、Sekiguchi T、Kinukawa H、Yoshimura T、Chayama K
  • 雑誌名: Journal of Viral Hepatitis 巻: 28 ページ: 1304～1311
  • DOI: 10.1111/jvh.13557
  • 査読あり
• [雑誌論文] MafF Is an Antiviral Host Factor That Suppresses Transcription from Hepatitis B Virus Core Promoter (2021)
  • 著者名/発表者名: Ibrahim Marwa K.、Abdelhafez Tawfeek H.、Takeuchi Junko S.、Wakae Kosho、Sugiyama Masaya、Tsuge Masataka、Ito Masahiko、Watashi Koichi、El Kassas Mohamed、Kato Takanobu、Murayama Asako、Suzuki Tetsuro、Chayama Kazuaki、Shimotohno Kunitada、Muramatsu Masamichi、Aly Hussein H.、Wakita Takaji
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 95 ページ: e0076721
  • DOI: 10.1128/JVI.00767-21
  • 査読あり
• [雑誌論文] Understanding Hepatitis B Virus Dynamics and the Antiviral Effect of Interferon Alpha Treatment in Humanized Chimeric Mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Reinharz Vladimir、Ishida Yuji、Tsuge Masataka、Durso-Cain Karina、Chung Tje Lin、Tateno Chise、Perelson Alan S.、Uprichard Susan L.、Chayama Kazuaki、Dahari Harel
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 95 ページ: e0049220
  • DOI: 10.1128/JVI.00492-20
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Increasing incidence of non-HBV- and non-HCV-related hepatocellular carcinoma: single-institution 20-year study (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagaoki Y, Hyogo H, Ando Y, Kosaka Y, Uchikawa S, Nishida Y, Teraoka Y, Morio K, Fujino H, Ono A, Nakahara T, Murakami E, Yamauchi M, Okamoto W, Kawaoka T, Tsuge M, Hiramatsu A, Miki D, Imamura M, Takahashi S, Chayama K, Aikata H.
  • 雑誌名: BMC Gastroenterology 巻: 21 ページ: 306
  • DOI: 10.1186/s12876-021-01884-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] インターフェロンによるB型肝炎ウイルス増殖抑制メカニズムに関する検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 柘植 雅貴
  • 雑誌名: Medical Science Digest 巻: 47 ページ: 43-46
• [学会発表] KIF4A, a new host factor required for surface localization of NTCP, and HBV/HDV infection (2021)
  • 著者名/発表者名: Gad SA, Sugiyama M, Tsuge M, Wakae K, Fukano K, Watanabe N, Kato T, Murayama A, Li Y, Shoji I, Shimotohno K, Chayama K, Muramatsu M, Wakita T, Nozaki T, Aly HH.
  • 学会等名: 2021 International HBV Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] HBV感染によるヒストン修飾と発癌との関連の検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 柘植 雅貴、竹内泰江、茶山一彰
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会 ワークショップ
• [学会発表] Entecavir投与中のB型慢性肝炎患者における血清オートタキシン濃度の変化と肝発がん予測への有用性 (2021)
  • 著者名/発表者名: 藤野初江、柘植 雅貴、茶山一彰
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会 パネルディスカッション
• [学会発表] エンテカビル治療B型慢性肝炎症例における 肝発癌・HBs抗原低下と血清サイトカインとの関連 (2021)
  • 著者名/発表者名: 柘植 雅貴、竹内泰江、茶山一彰
  • 学会等名: 第107回日本消化器病学会総会 シンポジウム
• [図書] 専門医のための消化器病学 第3版 (2021)
  • 著者名/発表者名: 柘植雅貴、茶山一彰
  • 総ページ数: 736
  • 出版者: 医学書院
  • ISBN: 978-4-260-04579-7