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葉緑体NAD(P)Hデヒドロゲナーゼ(NDH)は、葉緑体チラコイド膜上で、光合成に不可欠な循環的電子伝達経路を構成し、ストレス環境下で植物が必要とするATPの供給に寄与する。本研究では、NDHの分子実体の解明に焦点を絞り、バイオインフォマティクスと生化学を融合した独自の手法により未知のサブユニットを同定し、複合体全体の構造解明を目指す。
(1) 新規サブユニットの同定
共発現解析および系統プロファイリングという2つのバイオインフォマティクス・スクリーニングを改変、発展させることにより更なるNDHサブユニットの探索を行っている。
(2) 電子受容体サブユニットの同定
2-a) 点変異NDF4導入シロイヌナズナの作出
まずNDF4の構造をたもちつつFe-Sクラスターとの結合活性を失った点変異導入に関する類似タンパク質に関する先攻研究を参考にして点変異導入位置を決定してこれまでに、形質転換用コンストラクトを作成した。来年度は形質転換を試み、形質転換体におけるNDH活性、NDH複合体の存在様式を解析する。
2-b) NDF4とCRR1との相互作用の検証
BN-PAGEとイムノブロット解析の組み合わせにより両者の相互作用を検証する。NDF4については抗体を作成した。今後、その力値、特異性を調べ、ウエスタン解析に用いる予定。また、平行して、葉緑体の祖先である、シアノバクテリアのNDF4およびCRR1ホモログをノックアウトした株を作成したので、これらを用いて、葉緑体進化とNDH複合体電子受容部位の関係を明らかにする。
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