2022 年度実施状況報告書

Lynch-like syndromeには解析困難な遺伝性の症例が含まれる

研究課題

研究課題/領域番号	22K07266
研究機関	地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所)
研究代表者	山本剛地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 副部長 (80384189)
研究分担者	赤木究地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 病院腫瘍診断・予防科, 科長(兼)診療部長 (30244114) 井内勝哉地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 病院腫瘍診断・予防科, 技師 (40553847) 高橋朱実地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 病院腫瘍診断・予防科, 研究員 (40743620) 角田美穂地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 病院腫瘍診断・予防科, 研究員 (60347359)
研究期間 (年度)	2022-04-01 – 2025-03-31
キーワード	リンチ症候群 / Lynch-like syndrome / 遺伝学的検査 / ミスマッチ修復遺伝子 / バリアント
研究実績の概要	本年度は、腫瘍を入手可能な院内の症例について、腫瘍におけるMMR遺伝子のバリアントを解析した。その結果、Somaticにデータベースからも明らかな病的変異が存在し、さらに腫瘍含有率や周辺のCommon variantsのバリアントアレル頻度（VAF）からヘテロ接合性の消失（LOH）が起こっていると考えられる症例もあったが、腫瘍において病的意義不明（VUS）の変異が2hitで見られる症例等研究計画立案段階では少数と思われた症例がいくつか見つかった。当初予定されていたVUSを評価するプロジェクトに対する予算が付かなかったこともあり、我々はVUSの機能解析の重要性を考え、HAP1細胞にVUSのバリアントを導入し、6TG添加による細胞生存を解析する実験系を並行して立ち上げることとした。また、腫瘍を入手できない院外の症例については、まず免疫染色においてMLH1の欠失が見られる15症例ほどでMLH1プロモーター領域のメチル化解析を行った結果、2例でGermlineのメチル化を認めた。さらに免疫染色においてMSH2の欠失が見られる症例で、40歳以下で腫瘍を発症している症例に対して、EPCAM遺伝子エクソン9から、MSH2遺伝医の下流までの領域を約15kbpの7領域に分けてそれぞれLong PCRを行うプライマーを設計し、解析を行った。Inversion等の変化は検出されなかったが、3症例においてレアなバリアントをイントロンに検出した。イントロンのバリアントはスプライシング以外にも転写への影響が報告されているため、今後解析対象とする。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由機能解析が新たに計画に加わったが、MSH2遺伝子の全領域を解析するプライマーの設計、候補症例の解析等、順調に進んでいる。未だ確定的なバリアントは、MLH1プロモーター領域のGermline methylationのみであるが、比較的報告症例数の少ないGermline methylationが見つかったことは大きな成果と考えられる。
今後の研究の推進方策	本年度の解析結果から、腫瘍シーケンスにおいてもかなりの種類のVUSが検出されることが明らかとなった。HAP1細胞を用いた解析の対象となるバリアントをミスセンスのVUSまで広げて研究を計画することとした。その他の研究計画に変更はない。次年度は、本年度の研究に加えて、家系図や臨床所見から見ても強くリンチ症候群を疑う症例について、エクソーム解析を行っていく。
次年度使用額が生じた理由	研究計画の一部変更により、すでに購入済みの試薬などを研究に用いたこと、及び将来的なシーケンスコスト節約の為、PCR産物からNEXTERA XTを用いてライブラリを作成しシーケンスを行う実験系について、大幅なコストダウン（1/2程度）を行ったことが原因である。次年度研究においては、本年度HAP1細胞に導入したバリアントのクローニングや解析などの研究費用が必要となるため、次年度使用額はそれに当てられる。
備考	The International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours (InSiGHT)の活動の一環として、本研究も関連する形でMMR遺伝子のバリアント評価に関わるクライテリアの作成に参加した。