2023 年度実施状況報告書

Mycobacterium abscessusのヒト気道上皮細胞感染機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	22K16385
研究機関	公益財団法人結核予防会結核研究所
研究代表者	鎌田啓佑公益財団法人結核予防会結核研究所, 抗酸菌部細菌科, 医員 (80885666)
研究期間 (年度)	2022-04-01 – 2025-03-31
キーワード	M. abscessus / 気道上皮細胞 / 気相液相界面培養 / メタボローム解析
研究実績の概要	入手したヒト気道上皮初代細胞2系統(健常人中枢気道, COPD患者小気道由来の上皮細胞)について、Air-Liquid-Interface (ALI)培養でヒト上皮気道モデル作成を試みた。当初、気相液相界面培養後の気道上皮繊毛分化が安定しなかったが、マウス線維芽細胞(3T3J2)をfeeder cellとして使用するConditionally reprogrammed cells (CRC) 法を用いることによって安定した気道上皮モデル作成が可能になった。まず初めに感染がない状況でのヒト気道上皮モデル(中枢気道)における頂端側洗浄液および基底側培地の代謝物解析プロトコルを構築し、液体クロマトグラフ質量分析計を用いたワイドターゲット分析(親水性低分子代謝物144成分およびリン脂質867成分)によってそれぞれの代謝物プロファイルを評価した。リン脂質プロファイルに関しては定量のための適切な内部標準物質が設定されていなかったため主要脂質クラスの安定同位体を内部標準物質として登録するメソッド開発を行なった。続いて頂端側にM. abscessus(基準株ATCC19977)を感染させ、感染初期(24時間後)の代謝物変化を評価した。ヒト気道上皮モデルの頂端側洗浄液からは(親水性低分子代謝物39成分, リン脂質13成分)、基底側培地からは(親水性低分子代謝物67成分,リン脂質6成分)がそれぞれ同定された。主成分分析によって両者のプロファイルは明確に区別された。頂端側にM. abscessusを感染させることによって、頂端側洗浄液中のO-Phosphoethanolamine, Arginine, Niacinamideが減少した一方で、Lactic acid, Choline, Pantothenic acidは増加した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由 2022年度に気相液相界面培養のインサートが品薄のため入手困難であったことが進捗に大きく影響し、気道上皮傷害の条件検討を十分に行うだけの実験リソースを確保できなかった。代替インサートで気道上皮モデル作成が問題なく行えるかどうかについて追加検証が必要であった。当初、細胞内へのM. abscessusの直接侵入を評価項目としたが、免疫染色後の共焦点レーザー顕微鏡での侵入評価は表面接着と細胞内侵入を正確に見分けることが非常に難しく、今回のような少量菌を感染させる実験系の場合、電子顕微鏡で全てのサンプルを評価し定量化することもマンパワー的に困難であった。上記理由より、M. abscessusの細胞内直接侵入を評価する実験系を根本的に見直し、菌と気道上皮モデルのinteractionをメタボローム解析によって評価しすることによって初期の感染病態を探索する方針に変更した。
今後の研究の推進方策	気相液相界面培養によって作成されたヒト気道上皮モデルを3分画(頂端側洗浄液、細胞内、基底側培地)に分け、細胞内代謝物の代謝物プロファイルを評価するプロトコルを複数の細胞系で確認し問題ないか評価する。同一ドナー由来の近位気道と遠位気道上皮細胞から作成した気道上皮モデルにおける代謝物プロファイルの違いとM. abscessus感染によって影響を受ける代謝経路の変化を探索する。
次年度使用額が生じた理由	研究計画が予定より遅れ、当初の計画から変更となったため。遅れの主な原因としては2022年度に気相液相界面培養のインサートが品薄のため入手困難であったことが進捗に大きく影響し、気道上皮傷害の条件検討を十分に行うだけの実験リソースを確保できなかった。代替インサートで気道上皮モデル作成が問題なく行えるかどうかについて追加検証が必要であったことが挙げられる。また当初、細胞内へのM. abscessusの直接侵入を評価項目としたが、免疫染色後の共焦点レーザー顕微鏡での侵入評価は表面接着と細胞内侵入を正確に見分けることが非常に難しく、今回のような少量菌を感染させる実験系の場合、電子顕微鏡で全てのサンプルを評価し定量化することもマンパワー的に困難であった。次年度の使用計画としては、気相液相界面培養に用いる、培地、培養用インサートといった消耗品として利用する予定。