| 研究課題/領域番号 |
21J00910
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
清水 優太朗 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| キーワード | 膜交通 / ゴルジ体 / トランスゴルジ網 / シロイヌナズナ / 植物 |
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| 研究実績の概要 |
トランスゴルジ網（TGN）はゴルジ体から運ばれてきた積荷タンパク質やエンドサイトーシスされた積荷タンパク質を選別し最終目的地へ送り出す重要なオルガネラである。小胞体からゴルジ体、あるいはゴルジ体間の積荷タンパク質輸送機構についてはよく研究されている一方で、ゴルジ体とTGN間でどのように積荷タンパク質を輸送しているのか、その仕組みについては十分な知見がない。本研究課題の目的は、植物細胞を対象に、細胞生化学的手法とケミカルスクリーニングを駆使し、ゴルジ体とトランスゴルジ網間における積荷タンパク質輸送機構を明らかにすることである。今年度は、ゴルジ体あるいはTGNに局在するタンパク質に近位依存性ビオチン標識酵素を融合し、ゴルジ体とTGN間で機能するタンパク質群を同定するための植物体を作出した。ウェスタンブロッティングにより融合タンパク質特異的にビオチン標識されるタンパク質群が存在することを確認した。また、タバコBY-2細胞を対象に、ゴルジ体とTGN局在タンパク質の両方あるいはどちらか片方に影響を及ぼす化合物を効率的に探索するケミカルスクリーニングの基盤構築をおこなった。具体的にはゴルジ体マーカーとTGNマーカーを共発現するBY-2細胞を96ウェルプレート中で培養し、化合物処理後に自動で撮像をおこなうハイスループットスクリーニング系を構築した。約4000化合物を１次スクリーニングに供試し、複数のヒット化合物を得たが、シロイヌナズナを用いた2次スクリーニングで影響が見られなかったため、新たな化合物ライブラリを用いて1次スクリーニングを再度行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、上記実験系の基盤構築を主におこなった。ケミカルスクリーニングに用いる培養細胞の取得に時間がかかったことや、２次スクリーニングにおいてヒット化合物を得ることができなかったため、進捗状況はやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、低分子化合物が主に含まれる化合物ライブラリを用いてケミカルスクリーニングをおこなってきたが、今後は、高分子量の化合物が含まれる化合物ライブラリなど新たなライブラリを用いてスクリーニングを行う。また、近位依存性ビオチン標識法を利用して、ゴルジ体とTGN間に存在するタンパク質群を網羅的に同定する。ゴルジ体とTGN間に存在するタンパク質群の変異体を順次作出していく予定である。
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