Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ逆転写酵素阻害剤に対する耐性機序

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23590636
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 芦野 有悟 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20361082)
• 研究分担者: 児玉 栄一 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 講師 (50271151)
• キーワード: ウイルス / HIV / 薬剤耐性

研究概要

本邦で開発された核酸系逆転酵素阻害剤4'-ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine (EFdA)はこれまでにない逆転写酵素阻害機序、translocation阻害を有する。この機序の詳細な解明のために平成23年度からEFdAに対する耐性HIVを試験管内で誘導しそのウイルス学的解析を行っている。本年度はこれまで報告のある多剤耐性変異を同時に有する高度多剤耐性HIVに対するEFdAの効果を検討した。これらのウイルスであってもEFdAが効果を示すことを明らかとした。2次変異として同定されたA158TやT165M/Rのリコンビナント酵素を使用し解析したところ、酵素学的にも活性の低下や速度の低下が認められるが、耐性度に対して大きな影響を示さない点は、ウイルスの場合と一致した。
更に、ウイルスの複製能を詳細に調べ、耐性度と複製度の2次元での相関性を解析した。通常は耐性度と複製能は逆相関を示すことが多いが、EFdAの耐性変異の場合、耐性度をあまり獲得できないままに複製能を失う傾向にあり、耐性を獲得するにせよ、ウイルスにとってのコストがかなり大きくなることが予想された。これらのことを総合すると、HIVはEFdAに対して耐性を獲得しにくいだけでなく、獲得してもその代償としてウイルス複製能を大きく損なうことが明らかとなった。つまり、EFdAはこれまでの核酸系逆転写酵素阻害剤と比べ、非常に優れたプロフィールを有していることが明らかとなった。更にこれらの薬剤特性はエチニル誘導体に広く観察され、耐性に対する抵抗性ではdiamino-purin誘導体はEFdAを上回る耐性抵抗性を有していた。また、感染性のウイルス及び生化学的酵素アッセイから同等の結果が得られたことは、この結果が非常に確からしいことを裏づける。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

平成24年度は、研究協力者の成果もでており、当初予定されていたよりも研究が進み、前倒し申請をするに至った。またEFdAに関しては、臨床開発権の米国メルク社に24年度（8月）に導出することができた。変異を有する逆転写酵素の精製も順調に進んでおり、これらの解析を現在行っている。やや遅れ気味であったHIV-2における耐性誘導も本年度無事終了し、耐性関連変異も同定しえた。そのため解析が予定よりも進んでおり、全体としては予定通りよりも進行した達成状況にある。

今後の研究の推進方策

平成25年度
HIV-2における耐性ウイルスの解析というウイルス学的実験のほかに、細胞側の実験として、細胞内dNTP量測定と耐性変異を有するRTの作製を進める。細胞からメタノール抽出、DNA polymeraseを用いた測定法にて有効dNTP量を４種類に分けて測定する。ATP測定には市販されているATP測定キットを用いて行う。これらが耐性に及ぼす影響を検討する。耐性変異を有するRTの作製では変異を有するRTタンパクを大腸菌で発現させる。カラムで精製したのちRT反応を行い、反応液中のdNTPおよびATP濃度を変化させ、その活性の変化を検討する。
本年度は、残っている実験データの収集・解析を主に行い、一方で論文発表のためのデータをまとめて論文として投稿する予定である。これら以外は申請書作成時の計画どおりである。

次年度の研究費の使用計画

上記における試薬の購入(メタノール・カラム・ATP測定キットなど)及び論文投稿用費用に充てる。未使用金額の発生した理由としては、大腸菌で作製するRTタンパクが予想よりも高収量で得られ、培養関連の試薬購入費や生成費が予定よりも掛からなかったため。

研究成果

• [雑誌論文] Development of Small Molecule HIV-1 Fusion Inhibitors: Linking Biology to Chemistry. (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto F, Kodama EN
  • 雑誌名: Curr Pharm Des. 巻: 19 ページ: 1827～1834
  • DOI: 10.2174/1381612811319100007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanism of resistance to S138A substituted enfuvirtide and its application to peptide design. (2013)
  • 著者名/発表者名: Izumi K, Kawaji K, Miyamoto F, Shimane K, Shimura K, Sakagami Y, Hattori T, Watanabe K, Oishi S, Fujii N, Matsuoka M, Kaku M, Sarafianos SG, Kodama EN.
  • 雑誌名: Int J Biochem Cell Biol. 巻: 45 ページ: 908～915
  • DOI: 10.1016/j.biocel.2013.01.015.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Acyclovir reduces the duration of fever in patients with infectious mononucleosis-like illness. (2013)
  • 著者名/発表者名: Usami O, Saitoh H, Ashino Y, Hattori T.
  • 雑誌名: Tohoku J Exp Med. 巻: 229 ページ: 137-142.
  • DOI: org/10.1620/tjem.229.137
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biochemical, inhibition, and inhibitor resistance studies of xenotropic murine leukemia virus-related virus reverse transcriptase. (2012)
  • 著者名/発表者名: Tanyaradzwa P. Ei-Ichi Kodama, et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research 巻: 40 ページ: 345～359
  • DOI: 10.1093/nar/gkr694
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development and application of fluorescent SDF-1 derivatives. (2012)
  • 著者名/発表者名: Masuda R, Oishi S, Tanahara N, Ohno H, Hirasawa A, Tsujimoto G, Kodama E, Matsuoka M, Fujii N.
  • 雑誌名: Future Med Chem. 巻: 4 ページ: 837～844
  • DOI: 10.4155/fmc.12.31
  • 査読あり
• [雑誌論文] HIV-1 reverse transcriptase (RT) polymorphism 172K suppresses the effect of clinically relevant drug resistance mutations to both nucleoside and non-nucleoside RT inhibitors. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hachiya A, Marchand B, Kirby KA, Michailidis E, Tu X, Palczewski K, Ong YT, Li Z, Griffin DT, Schuckmann MM, Tanuma J, Oka S, Singh K, Kodama EN, Sarafianos SG.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 287 ページ: 29988～29999
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.351551.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of translocation defective reverse transcriptase inhibitors on the activity of N348I, a connection subdomain drug resistant HIV-1 reverse transcriptase mutant. (2012)
  • 著者名/発表者名: Michailidis E, Singh K, Ryan EM, Hachiya A, Ong YT, Kirby KA, Marchand B, Kodama EN, Mitsuya H, Parniak MA, Sarafianos SG.
  • 雑誌名: Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 巻: 58 ページ: 187～195
  • DOI: 10.1155/2012/586401
  • 査読あり
• [雑誌論文] Elevated anti-tuberculous glycolipid antibody titres in healthy adults and tuberculosis patients in Thailand. (2012)
  • 著者名/発表者名: Siddiqi UR, Punpunich W, Chuchottaworn C, Jindakul S, Ashino Y, Saitoh H, Okada M, Chotpittayasunondh T, Hattori T
  • 雑誌名: Int J Tuberc Lung Dis. 巻: 4 ページ: 532-538
  • DOI: 10.5588/ijtld.10.0764.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rapid decrease of plasma galectin-9 levels in patients with acute HIV infection after therapy. (2012)
  • 著者名/発表者名: Saitoh H, Ashino Y, Chagan-Yasutan H, Niki T, Hirashima M, Hattori T.
  • 雑誌名: Tohoku J Exp Med. 巻: 228 ページ: 157-161.
  • DOI: doi.org/10.1620/tjem.228.157
  • 査読あり
• [雑誌論文] Distinct clinical features in nontuberculous mycobacterial disease with or without latent tuberculosis infection. (2012)
  • 著者名/発表者名: Siddiqi UR, Chagan-Yasutan H, Nakajima C, Saitoh H, Ashino Y, Usami O, Shiratori B, Usuzawa M, Suzuki Y, Hattori T.
  • 雑誌名: Tohoku J Exp Med. 巻: 226 ページ: 313-319.
  • DOI: org/10.1620/tjem.226.313
  • 査読あり
• [学会発表] MINICICLIN投与によるヒト免疫不全ウイルス(HIV)持続感染への効果 (2012)
  • 著者名/発表者名: 芦野有悟、宇佐美修、齊藤弘樹、服部俊夫、賀来満夫
  • 学会等名: 第26回日本エイズ学会学術集会
  • 発表場所: 神奈川
  • 年月日: 20121124-20121126
• [学会発表] 4'-Ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine (EFdA), a translocation defective reverse transcriptase inhibitor with highly potent activity against diverse multi-drug-resistant HIV-1 variants. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hiroaki Mitsuya, Eiichi Kodama, Hirotomo Nakata, Shinichro Hattori, Seiji Okada, Kenji Maeda, Michael A. Parniak, and Stefan G. Sarafianos.
  • 学会等名: 13th Kmamoto AIDS Seminar-GCOE Joint International Symposium
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 20121024-20121026
• [学会発表] Combinations of 4'-ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine with rilpivirine show synergistic anti-HIV activity in vitro. (2012)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Hachiya, Eiichi N. Kodama et al.
  • 学会等名: 13th Kmamoto AIDS Seminar-GCOE Joint International Symposium
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 20121024-20121026
• [学会発表] Administration of Acyclovir for Acute Lymphadenopathy Reduces Duration of Hospitalization and Febrile Period (2012)
  • 著者名/発表者名: Yugo Ashino, Osamu Usami, Hiroki, Saitoh, and Toshio Hattori
  • 学会等名: 第9回日中ウイルス学会
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 20120611-20120613
• [学会発表] A novel peptide derived from measles virus fusion protein inhibits the replication of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) virus in vitro and in vivo. (2012)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Watanabe, Koichi Hashimoto, Yusaku Abe, Eiichi Kodama, Ryota Nabika, Shinya Oishi, Nobutaka Fujii, Mitsuaki Hosoya
  • 学会等名: 25th International Conference on Antiviral Research.
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 20120416-20120419
• [学会発表] The Combination of 4'-Ethynyl-2-Fluoro-2'-Deoxyadenosine with Rilpivirine Shows Synergistic Anti-HIV-1 Activity In Vitro. (2012)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Hachiya, Bruno Marchand, Eleftherios Michailidis, Eiichi N Kodama, Michael A Parniak, Hiroaki Mitsuya, Shinichi Oka, Stefan G Sarafianos.
  • 学会等名: 25th International Conference on Antiviral Research.
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 20120416-20120419
• [学会発表] Effect of 4'- and 2-NRTI Substitutions on the Inhibition Mechanism of HIV Reverse Transcriptase and Toxicity. (2012)
  • 著者名/発表者名: Eleftherios Michailidis, Jordan Wilkins, Emily M. Ryan, Atsuko Hachiya, Eiichi N. Kodama, Hiroaki Mitsuya, Michael A. Parniak, Stefan G. Sarafianos.
  • 学会等名: 25th International Conference on Antiviral Research.
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 20120416-20120419
• [学会発表] Sustained Activity of 4'-Ethynyl Nucleosides to Variants with M184V Mutation in HIV-1 Reverse Transcriptase. (2012)
  • 著者名/発表者名: Fusako Miyamoto, Kumi Kawaji, Toshio Hattori, Hiroaki Mitsuya, Stefan G. Sarafianos, Eiichi N. Kodama.
  • 学会等名: 25th International Conference on Antiviral Research.
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 20120416-20120419