| 研究課題/領域番号 |
23590649
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
岩本 武夫 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (90568891)
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| キーワード | 合成ペプチド / 新規ベクター / ファブリー病 / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
ナノベシクルペプチドベクターの粒径を動的光散乱法で測定した結果、直径と20μmと160 nmの大小ベシクルが観測され、その大小の分布比は17：3を示し、大半は160 nmのベシクルであることが分かった。
メチル水銀を３０％標識したh5とh9分枝ペプチドを添加し形成したベシクルを詳細に調べるため走査透過型電子顕微鏡（STEM）で測定した。その結果、直径はおよそ200 nmを示した。またニ分子膜で形成されるベシクルは構造上両層に検出されるはずだが、メチル水銀は外膜層にのみ検出され内膜層には検出されなかった。このことはベシクル形成のメカニズムを知るうえで重要な知見を与えた。
Tatエピトープの修飾率の異なるペプチドベクターを293A細胞株に加え発現したGFP蛍光強度をフローサイトメトリーで測定し評価した。その結果Tatエピトープの修飾効果はこの細胞株では顕著に修飾効果を示さなかった。今後は培養細胞株の種類に依存するかについて検討を行う予定である。
h5、h9分枝ペプチドベクター表面のポリカチオンに起因する細胞毒性を検討するため、ペプチドベクター濃度とプラスミドDNA量に関して検討を行った。その結果、12 pmolのプラスミドDNAを含む160μMのペプチドベクターが導入率として最適であることが分かった。また1 mMのペプチドベクターを投与すると５０％の細胞がダメージを受けることが分かった。
２５年度に予定しているペプチドベクター投与による免疫反応で惹起されるマウス血清中IgGの定性と定量法を前倒して検討した。その結果、電気泳動法とLC-MS/MSを用いたプロテオミクスを用いた高精度なIgG定量法を確立した。またペプチドベクターに起因するIgGかどうかをタンパク質相互作用により確認するため、血清中IgGの分取システムを分子篩クロマトグラム法を用い確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
動物実験に移る前に必要な試料の分取法と測定手法の開発を前倒しに進めている。そのため動物実験への移行が遅れているが、貴重な実験動物を取り行う観点からも十分な基礎知見の検討と準備をしてから取り組みたいと思っている。細胞レベルでの情報はある程度得られたが、種類の違う培養細胞株についての知見がまだ十分に得られていないため、動物実験に移行できていない。そのためやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
２５年度前期は種類の異なる培養細胞株を用い前年度と同様な実験を行い遺伝子導入率について検討を重ねる。これまでの結果をもとにマウスへベクターを直接投与するか遺伝子導入した細胞を投与するか判定を行う。細胞において発現率の良かった手法を用いてベクターをマウスに投与し各組織でのＧＦＰ発現率を調べ、投与量の最適化を図る。
２５年度前期は種類の異なる培養細胞株を用い前年度と同様な実験を行い遺伝子導入率について検討を加える。これらの結果をもとにマウスへベクターを直接投与するか遺伝子導入した細胞を投与するか判定を行う。細胞において発現率の良かった手法を用いてベクターをマウスに投与し各組織でのＧＦＰ発現率を調べ、投与量の最適化を図る。また各臓器における酵素活性や遺伝子導入を確認し、新規ペプチドベクターによる遺伝子治療の効果を判定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究が動物実験レベルに移行するため、動物の購入及びその維持管理、更にこれに応じた多量なペプチド化合物が必要になる。２５年度研究費はこれらに対処するために使用する予定である。とくにペプチド合成のスケールアップが必須である。そのため研究代表者が４週間かけて直接Kansas州立大学で多量の化学合成と精製を行い、また研究協力者であるTomich教授と研究打ち合わせも行う予定である。これらのことを遂行するために、米国への渡航費用として使用する予定である。
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