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2012 年度 実施状況報告書

ミトコンドリア集積性アルギニンペプチドの機能評価と活性分子送達への応用

研究課題

研究課題/領域番号 23790129
研究機関京都大学

研究代表者

中瀬 生彦  京都大学, 化学研究所, 助教 (40432322)

キーワード膜透過性ペプチド / ミトコンドリア / 薬物送達 / アルギニン
研究概要

細胞内への薬物送達キャリアーとして、HIV-1 Tatペプチドやオクタアルギニン(R8)などの、塩基性アミノ酸に富む膜透過性ペプチドが近年広く用いられている。本研究では、細胞内の特定オルガネラ、特にエネルギー産生や細胞の生死に関わるミトコンドリアに着目し、ミトコンドリア標的能を有する膜透過性ペプチドの創製を試みた。
本研究では、脂質膜においてα-ヘリックス構造をとる両親媒性ペプチド、KLAペプチド((KLAKLAK)2、全てD体)を基に、ミトコンドリア標的ペプチドをデザインし、それぞれの細胞内移行量や細胞内局在を検討した。KLAペプチドの全てのリジンをアルギニンに変えたRLAペプチドは、ヘリックス構造が保持され、KLAペプチドと比較して約40倍もの高い細胞内移行効率を示し、かつ高いミトコンドリア集積性を示すことを確認した。一方で、RLAペプチドと同じアルギニン残基数をもつが、ヘリックス含量を低下させた類縁ペプチドでは、形質膜透過効率が著しく低下することから、ヘリックス構造がペプチドの細胞膜透過に重要であることが明らかとなった。また、細胞内移行メカニズムを調べた実験では、エンドサイトーシスが阻害される低温条件において、ペプチドの細胞膜透過効率及びミトコンドリア集積性の低下が観察されたことから、RLAペプチドの細胞内移行にはエンドサイトーシス経路の大きな関与が示唆された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

現在までの研究の達成度として、おおむね順調に進展していると判断できる。これまで、膜透過性ペプチドを細胞内導入キャリアーとして用いて目的物質を細胞内へ送達させる手法が幅広く利用されているが、細胞内へ送達される場所はサイトゾル及び核内へ拡散する場合がほとんどで、目的物質が本来送達されるべき細胞内の特定のオルガネラへの送達効率は悪いと考えられている。本研究課題ではKLAペプチドを基に、ミトコンドリアへの特異的な薬物送達が可能な膜透過性ペプチドの創出を行った結果、アルギニン残基に富むKLA類縁体であるRLAが非常に効率よく細胞形質膜を通過し、ミトコンドリアへ局在することを明らかにした。また、RLAの細胞形質膜の透過効率は、ペプチドのヘリックス構造が大切であることも示され、同じアルギニン残基数でもヘリックス含量が低いと移行効率が極端に低下するといったペプチドの構造的な観点からも膜透過機序を明らかにすることができた。さらに、細胞によるエンドサイトーシス経路でのペプチドの取り込みが、RLAペプチドの細胞内移行に大きく関わっていることも初めて明らかとなった。以上の結果は、当初の研究計画を成功裏に遂行できた成果であると考えられる。

今後の研究の推進方策

(1)RLAペプチドの細胞膜透過メカニズムの検討
RLAペプチドの細胞内移行が、ペプチドのヘリックス構造及び、エンドサイトーシス経路による細胞取り込みが重要であることが本研究から明らかになったものの、細胞膜透過が移行経路のどの時点で生じているのかは明確になっていない。そこで、既存の膜透過性アルギニンペプチドとの場合と比較を行うことで、RLAペプチドの移行機序の解明及び移行様式の違いを詳細に検討する。具体的な実験として、(1) 各種エンドサイトーシス阻害剤による移行への影響、(2)細胞内トラフィック阻害剤(例えば、early endosomeからlate endosomeへの移行阻害剤や、エンドソーム内pH低下阻害剤等)による影響、(3)糖鎖欠失細胞株(CHO-pgs A745やpgs D677等)を用いた細胞膜集積性及び細胞取り込みへの影響について検討する。
(2)対イオンを用いたRLAペプチドの細胞膜透過効率の上昇
これまで、既存のアルギニンペプチドの細胞内移行において、対イオンを用いることでペプチドの膜透過性が格段に上昇することが見出されている。特にピレンブチレートを対イオンとして使用することで、膜透過性アルギニンペプチドの一種であるTat (48-60)ペプチドやオクタアルギニン(R8)ペプチドの細胞膜透過性が著しく上昇することが明らかとなっている。そこで、RLAペプチドに関しても対イオンを用いることで細胞膜透過効率が高まるか詳細に検討を行う。また、タンパク質等の巨大カーゴ分子が付加したRLAペプチドに関しても、対イオンを用いた場合の細胞内移行促進や、細胞内局在及びカーゴ分子の活性への影響について検討する。

次年度の研究費の使用計画

経費は主に、“今後の研究の推進方策”の研究を達成する為のペプチド合成用の有機系試薬(アミノ酸、ペプチド合成用レジン、縮合剤等)や、細胞培養試薬、細胞培養プラスチック製品、細胞実験用プラスチック製品(共焦点顕微鏡観察用、フローサイトメトリー実験用等)等の消耗品購入及び、国内・海外で開催される学会等における研究成果発表の旅費等に充てる。

  • 研究成果

    (18件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (11件) (うち招待講演 5件) 図書 (2件)

  • [雑誌論文] Transformation of an antimicrobial peptide into a plasma membrane-permeable, mitochondria-targeted peptide via the substitution of lysine with arginine2012

    • 著者名/発表者名
      Ikuhiko Nakase, Shinya Okumura, Sayaka Katayama, Hisaaki Hirose, Sílvia Pujals, Hirofumi Yamaguchi, Satoko Arakawa, Shigeomi Shimizu, Shiroh Futaki
    • 雑誌名

      Communications

      巻: 48 ページ: 11097-11099

    • DOI

      10.1039/c2cc35872g

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Bioinspired mechanism for the translocation of peptide through the cell-membrane2012

    • 著者名/発表者名
      Kazutami Sakamoto, Kenichi Aburai, Taku Morishita, Kenichi Sakai, Hideki Sakai, Masahiko Abe, Ikuhiko Nakase, and Shiroh Futaki
    • 雑誌名

      Chemistry Letters

      巻: 41 ページ: 1078-1080

    • DOI

      10.1246/cl.2012.1078

    • 査読あり
  • [雑誌論文] The effect of the attachment of a penetration accelerating sequence and the influence of hydrophobicity on octaarginine-mediated intracellular delivery2012

    • 著者名/発表者名
      Kentaro Takayama, Hisaaki Hirose, Gen Tanaka, Silvia Pujals, Sayaka Katayama, Ikuhiko Nakase, Shiroh Futaki
    • 雑誌名

      Molecular Pharmaceutics

      巻: 9 ページ: 1222-1230

    • DOI

      10.1021/mp200518n

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Signal transduction of biological systems through an artificial receptor system via dimerization of a bivalent leucine-zipper ligand2012

    • 著者名/発表者名
      Ikuhiko Nakase, Shinya Okumura, Gen Tanaka, Katsuhiro Osaki, Miki Imanishi, Shiroh Futaki
    • 雑誌名

      Angewandte Chemie International Edition

      巻: 51 ページ: 7464-7467

    • DOI

      10.1002/anie.201201805

    • 査読あり
  • [雑誌論文] CXCR4 stimulates macropinocytosis: implications for cellular uptake of arginine-rich cell-penetrating peptides and HIV2012

    • 著者名/発表者名
      Gen Tanaka, Ikuhiko Nakase, et al.
    • 雑誌名

      Chemistry & Biology

      巻: 19 ページ: 1437-1446

    • DOI

      10.1016/j.chembiol.2012.09.011

    • 査読あり
  • [学会発表] 膜透過性アルギニンペプチドを用いた効率的な細胞内導入2013

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦
    • 学会等名
      ペプチド研究所 若手セミナー
    • 発表場所
      株式会社ペプチド研究所、大阪・彩都
    • 年月日
      20130308-20130308
    • 招待講演
  • [学会発表] Creation of artificial epidermal growth factor receptor activated by bivalent leucine-zipper ligand2012

    • 著者名/発表者名
      Ikuhiko Nakase, Gen Tanaka, Shinya Okumura, Katsuhiro Osaki, Shiroh Futaki
    • 学会等名
      The 2nd International Conference on MEXT Project of Integrated Research on Chemical Synthesis “Molecular Functions in Complex Systems”
    • 発表場所
      名古屋大学
    • 年月日
      20121210-20121210
  • [学会発表] アルギニンペプチドの効率的な細胞内移行:機序と展開2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦
    • 学会等名
      第34回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
    • 発表場所
      京都大学
    • 年月日
      20121116-20121116
    • 招待講演
  • [学会発表] ミトコンドリアを標的とする膜透過ペプチドの創製と活性分子の細胞内送達2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦、片山沙綾香、奥村真也、二木史朗
    • 学会等名
      第49回ペプチド討論会
    • 発表場所
      かごしま県民交流センター
    • 年月日
      20121109-20121109
  • [学会発表] ミトコンドリアを標的とする細胞膜透過ペプチドベクターの創製2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦、片山沙綾香、奥村真也、二木史朗
    • 学会等名
      第6回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      北海道大学
    • 年月日
      20120906-20120906
  • [学会発表] ロイシンジッパー二量体リンカーを用いた受容体の活性化とシグナル誘導2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦、奥村真也、田中弦、大崎勝弘、今西未来、二木史朗
    • 学会等名
      第6回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      北海道大学
    • 年月日
      20120906-20120906
  • [学会発表] 細胞機能探索に有用なペプチドツール~細胞内導入と受容体創製~2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦
    • 学会等名
      サントリー生命科学財団 生物有機科学研究所シンポジウム
    • 発表場所
      サントリー生命科学財団 生物有機科学研究所
    • 年月日
      20120827-20120827
    • 招待講演
  • [学会発表] In vivoにおけるアルギニンペプチドの腫瘍集積と抗癌剤送達への応用2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦、小西雄介、上田真史、佐治英郎、二木史朗
    • 学会等名
      第28回日本DDS学会学術集会
    • 発表場所
      札幌コンベンションセンター
    • 年月日
      20120705-20120705
  • [学会発表] 膜透過性ペプチドの効率的な細胞内移行2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場
    • 年月日
      20120620-20120620
    • 招待講演
  • [学会発表] ヘリックス相互作用で活性化可能な人工EGF受容体の創製と細胞機能制御2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦、大崎勝弘、奥村真也、二木史朗
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会 第7回年会
    • 発表場所
      京都大学
    • 年月日
      20120609-20120609
  • [学会発表] Efficient internalization of arginine-rich cell-penetrating peptide through cell membranes2012

    • 著者名/発表者名
      Ikuhiko Nakase, Shiroh Futaki
    • 学会等名
      Satellite mini-workshop of IACIS 2012
    • 発表場所
      千葉科学大学
    • 年月日
      20120512-20120512
    • 招待講演
  • [図書] 遺伝子医学 MOOK「最新ペプチド合成技術とその創薬研究への応用」2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦、田中弦、二木史朗
    • 総ページ数
      173-178
    • 出版者
      メディカルドゥ
  • [図書] 試料分析講座「タンパク質分析」日本分析化学会編2012

    • 著者名/発表者名
      中瀬生彦、二木史朗
    • 総ページ数
      219-231
    • 出版者
      丸善出版

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公開日: 2014-07-24  

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