| 研究課題/領域番号 |
20H03159
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
的場 章悟 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 専任研究員 (20585202)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 胎盤 / アミノ酸トランスポーター / 代謝プログラミング / SNATファミリー / 胎盤特異的ノックアウト |
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| 研究実績の概要 |
本年度は昨年度に引き続き、SNATファミリー遺伝子の新規KOマウスライン作成を進めつつ、これまで作製してきた各種SNAT遺伝子のKOが胎盤および胎児の発生へ与える影響を解析した。
(1) Slc38a1, Slc38a2, Slc38a4のトリプルKOマウスの作製および解析。
SNATファミリーをコードするSlc38a1, Slc38a2,Slc38a4の3遺伝子の全領域を欠損するマウスライン（SNAT KO）を樹立したところ、SNAT Null KO胚は着床後の早い段階で胎性致死を示すことが分かった。Slc38a4単独Null KOでも出生には至るので、SNATファミリー遺伝子が胚発生で相補し合っていることが明らかになった。
また、父方からKOアリルを引き継いだSNAT paternal KO (PKO)マウスも出生するものの、完全な生後致死を示した。Slc38a4単独のPKO個体も生後致死を示すものの、2-3割程度の個体は成体まで発育するため、Slc38a4 PKOではSlc38a1およびSlc38a2が機能補償していることが明らかになった。今後はさらに詳細な表現型解析を進める予定である。
(2) SNAT遺伝子の胎盤特異的コンディショナルKO（cKO）マウスの作製。
Slc38a4単独の胎盤特異的cKOマウスを作成し、Slc38a4の胎盤での機能欠損が胎児発生に与える影響を解析する。Slc38a4のExon4を挟む形でloxpを二か所に挿入したfloxマウスをCRISPRによって確立した（Slc38a4-Ex4-flox）。全身でCreを発現するCAG-Creとの交配および、Cre mRNAのエレクトロポレーション法によって、Slc38a4のExon4が欠失することを確認した。また、通常のSlc38a4全遺伝子領域KOマウスと同様に胎仔・胎盤重量の低下を示すことを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まず計画していた通り、SNATファミリー遺伝子のトリプルノックアウトマウスの作製に成功し、その解析を進めた。このマウスはSNAT4/Slc38a4の単独ノックアウト）よりも重篤な表現型を示すことが想定されたが、予想通りSNATファミリーNull KOは着床後の比較的早い段階で胎性致死を示すことが明らかになった。さらにSNAT PKOマウスも、Slc38a4 KOよりも重篤な表現型を示しており、SNATファミリー遺伝子間に相互補償するシステムがあることを明らかにした。表現型について詳さらに細に解析を進めており、まとまり次第学会および論文として発表予定である。
また、コンディショナルノックアウトについても様々な条件を検討し、loxpの挿入条件を確立した。Slc38a4-Ex4-floxマウスがCre依存的にSlc38a4の機能欠損を起こすことを確認しており、今後は胎盤特異的なCreマウス、および胎仔特異的なCreマウスとの交配を進めることで、Slc38a4の胎盤での機能および胎仔側（肝臓）での機能を切り分けて解析を進めることができるようになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度はSNATファミリー遺伝子のNull KOマウスおよびPKOマウスの表現型解析をさらに進める。これまでの研究からNull KO胚はE11.5までに致死であることが分かった。今後はさらにステージをさかのぼり、E6.5~E10.5などのステージを解析する。細胞増殖、および細胞分化への影響は、増殖・アポトーシス・細胞種特異的マーカーなどによる組織解析に加えて胎盤全体を用いたトランスクリプトーム解析も検討する。またその基盤情報として、SNAT1, SNAT2, SNAT4の各発生段階での局在ダイナミクスを免疫組織化学などにより詳細に解析する。また、SNAT PKOマウスは生後致死を示すので、その生育などの表現型を詳細に解析し、致死原因を解明する。
一方でSlc38a4-Ex4-floxマウスと胎盤特異的なCreマウス、および胎仔特異的なCreマウスとの交配を進めることで、Slc38a4の胎盤での機能および胎仔側（肝臓）での機能を切り分けて解析を進める。特に、胎盤特異的Slc38a4 コンディショナルKO (CKO)マウスで胎仔の生育や代謝プログラムに変化が起きるのかについて着目して解析を進める。
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