新規遺伝子改変動物と患者ｉＰＳを利用した分子病態に基づくてんかんの革新的治療開発

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24249060
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 廣瀬 伸一 福岡大学, 医学部, 教授 (60248515)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: てんかん / ドラベ症候群 / 遺伝子 / 遺伝子改変動物 / 薬剤スクリーニング

研究概要

てんかんの病態は長い間不明であったが、最近の分子生物学の発展に伴い遺伝子異常が発見されるようになった。しかしながら、その遺伝子異常がヒト脳内でどのような病態を引き起こしているのかは、ヒト脳を利用する他なく困難と考えられてきた。ところが、最近患者由来のiPS細胞を神経細胞等に分化誘導することにより、ヒト脳での病態研究が望める可能性が生まれた。
我々はナトリウムチャネルをコードする遺伝子、ＳＣＮ１Ａの異常により起こるドラベ症候群の患者より樹立したiPS細胞から、神経を分化させることに世界に先駆け成功した。これにより、ドラベ症候群の分子病態を明らかにすることができた。さらにこの細胞を用いて、そのＳＣＮ１Ａの異常をＴＡＬＥＮによる方法で、修復することに成功した。
てんかんでの遺伝子異常の発見により、その遺伝子異常をもつ動物を、遺伝子操作で作出することができるようになった。我々はドラベ症候群でみられるようなＳＣＮ1Ａの遺伝子の微少欠失を持つマウスの作出に成功した。さらにＴＡＬＥＮ技術を使い、ラットのＳＣＮ1Ａの遺伝子に変異を導入することに成功した。
今後は、樹立したiPS細胞を用いて、病態の回復を指標として多種の薬剤をスクリーニングすることにより、効果のある薬剤のシーズの探索を行う。同様に作出した動物を用いて、病態に基づく治療薬のシーズとなる薬剤のスクリーニングを行う。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

ナトリウムチャネルをコードする遺伝子、ＳＣＮ１Ａの異常により起こるドラベ症候群の患者より樹立したiPS細胞から神経を分化させることに世界に先駆け成功した。これにより、ドラベ症候群の分子病態を明らかにすることができた。すなわち、ドラベ症候群の病態がGABA系神経細胞の活動電位の減弱によることを世界に先駆けて明らかにすることができた。これの知見により、ドラベ症候群の病態は抑制神経系の不全によることが証明された。今までＳＣＮ１Ａの異常を持つマウスで観察されていたドラベ病態を、初めてヒトで再現した事例となった。さらに、ドラベ症候群ではナトリウムチャネル阻害効果がある、抗てんかん薬は患者の症状を悪化させることが知られていたが、その理由がこれらに抗てんかん薬は抑制神経系の不全をさらに悪化させることによることを明確に示すことができた。
ドラベ症候群のiPS細胞の遺伝子修復をＴＡＬＥＮ技術で実施することができた。知りうる限り、ドラベ症候群のiPS細胞の遺伝子修復例は他に報告がない。これにより、本研究の最終目的である、難治性てんかんの遺伝子修復による治療開発へ大きく近づくことになった。これは同時に、健常者由来のiPS細胞にドラベ症候群の任意の遺伝子異常を導入することができることを意味しており、希少疾患であるドラベ症候群の患者よりiPS細胞を樹立する要なく、様々な変異によるドラベ症候群の病態研究が行えるようになったと言える。
またドラベ症候群でみられるようなＳＣＮ1Ａの遺伝子の微少欠失を持つマウスの作出に成功した。この動物はヒトのドラベ症候群で見られる激しいてんかん発作が観察された。さらにＴＡＬＥＮ技術を使い、ラットのＳＣＮ1Ａの遺伝子にナンセンス変異を導入することに成功し、現在その表現型を確認中である。

今後の研究の推進方策

iPS細胞を使用した病態研究が有用と判明したので、今後は対象をできるだけ多くのてんかん病型へ広げる。また、成功したＴＡＬＥＮ技術を使用して、健常者より樹立したiPS細胞へ、てんかんで発見された変異を導入し、人工的に病的iPS細胞を作成する。このようにして準備したiPS細胞の分子病態を解析するとともに、その病態を改善する作用のある薬剤のスクリーニングを、ハイスループットで開始する。特に用いる薬剤はすでに他の効用で認可されている医薬品を使うことを計画している。
同様にＳＣＮ1Ａの遺伝子の微少欠失を持つマウスと、ＴＡＬＥＮ技術を使ってＳＣＮ1Ａの遺伝子にナンセンス変異を導入したラットを利用して、てんかん発作を軽減するような薬剤のスクリーニングを行う予定である。この薬剤の情報は前述のiPS細胞によるスクリーニングとの間で相互補完を行う。
iPS細胞および、遺伝子改変動物の作出は当初の計画以上に進展しているため、その技術の基になる、てんかん患者での遺伝子変異の検索を加速する。具体的にはキャピラリーシークエンサーによる変異検索を、次世代シークエンサーを用いて行う。

研究成果

• [雑誌論文] SCN1A testing for epilepsy: application in clinical practice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirose S, Scheffer IE, Marini C, De Jonghe P, Andermann E, Goldman AM, Kauffman M, Tan NC, Lowenstein DH, Sisodiya SM, Ottman R, Berkovic SF, Genetics Commission of the International League Against E.
  • 雑誌名: Epilepsia 巻: 54 ページ: 946-952
  • DOI: 10.1111/epi.12168
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of severe progressive early-onset epileptic encephalopathy: unique GABAergic interneuron distribution and imaging. (2013)
  • 著者名/発表者名: Inoue T, Kawawaki H, Kuki I, Nabatame S, Tomonoh Y, Sukigara S, Horino A, Nukui M, Okazaki S, Tomiwa K, Kimura-Ohba S, Inoue T, Hirose S, Shiomi M, Itoh M.
  • 雑誌名: J Neurol Sci. 巻: 327 ページ: 65-72
  • DOI: 10.1016/j.jns.2013.01.038
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of ATP1A3 mutations by exome sequencing as the cause of alternating hemiplegia of childhood in Japanese patients. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Saito Y, Mitsui J, Ishiura H, Yoshimura J, Arai H, Yamashita S, Kimura S, Oguni H, Morishita S, Tsuji S, Sasaki M, Hirose S.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 8 ページ: e56120
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0056120
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic analysis of PRRT2 for benign infantile epilepsy, infantile convulsions with choreoathetosis syndrome, and benign convulsions with mild gastroenteritis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Yasumoto S, Ihara Y, Inoue T, Fujita T, Nakamura N, Ohfu M, Yamashita Y, Takatsuka H, Taga T, Miyata R, Ito M, Tsuchiya H, Matsuoka T, Kitao T, Murakami K, Lee WT, Kaneko S, Hirose S.
  • 雑誌名: Brain Dev 巻: 35 ページ: 524-530
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2012.09.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] PCDH19-related female-limited epilepsy: further details regarding early clinical features and therapeutic efficacy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Higurashi N, Nakamura M, Sugai M, Ohfu M, Sakauchi M, Sugawara Y, Nakamura K, Kato M, Usui D, Mogami Y, Fujiwara Y, Ito T, Ikeda H, Imai K, Takahashi Y, Nukui M, Inoue T, Okazaki S, Kirino T, Tomonoh Y, Inoue T, Takano K, Shimakawa S, Hirose S.
  • 雑誌名: Epilepsy Res 巻: 106 ページ: 191-199
  • DOI: 10.1016/j.eplepsyres.2013.04.005.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A human Dravet syndrome model from patient induced pluripotent stem cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Higurashi N, Uchida T, Lossin C, Misumi Y, Okada Y, Akamatsu W, Imaizumi Y, Zhang B, Nabeshima K, Mori MX, Katsurabayashi S, Shirasaka Y, Okano H, Hirose S.
  • 雑誌名: Mol Brain 巻: 6 ページ: 19
  • DOI: 10.1186/1756-6606-6-19.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A recurrent KCNT1 mutation in two sporadic cases with malignant migrating partial seizures in infancy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Shioda M, Okumura A, Kidokoro H, Sakauchi M, Shimada S, Shimizu T, Osawa M, Hirose S, Yamamoto T.
  • 雑誌名: Gene 巻: 531 ページ: 467-471
  • DOI: 10.1016/j.gene.2013.08.096
  • 査読あり
• [雑誌論文] Current Trends in Dravet syndrome Research. (2013)
  • 著者名/発表者名: Higurashi N, Uchida T, Hirose S, Okano H.
  • 雑誌名: J Neurol Neurophysiol. 巻: 4 ページ: 152
  • DOI: 10.4172/2155-9562.1000152
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel prophylactic effect of furosemide treatment on autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE). (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamada J, Zhu G, Okada M, Hirose S, Yoshida S, Shiba Y, Migita K, Mori F, Sugawara T, Chen L, Liu F, Yoshida S, Ueno S, Kaneko S.
  • 雑誌名: Epilepsy Res. 巻: 107 ページ: 127-137
  • DOI: 10.1016/j.eplepsyres.2013.08.018
  • 査読あり
• [雑誌論文] ADORA2A polymorphism predisposes children to encephalopathy with febrile status epilepticus. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shinohara M, Saitoh M, Nishizawa D, Ikeda K, Hirose S, Takanashi J, Takita J, Kikuchi K, Kubota M, Yamanaka G, Shiihara T, Kumakura A, Kikuchi M, Toyoshima M, Goto T, Yamanouchi H, Mizuguchi M.
  • 雑誌名: Neurology. 巻: 80 ページ: 1571-1576
  • DOI: 10.1212/WNL.0b013e31828f18d8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of SCN1A mutations in patients with severe myclonic epilepsy in infancy by custom resequence array. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sugawara T, Yoshida S, Onodera N, Wada K, Hirose S, Kaneko S.
  • 雑誌名: Journal of Epileptology. 巻: 21 ページ: 5-13
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel HCN2 Mutation Contributes to Febrile Seizures by Shifting the Channel's Kinetics in a Temperature-Dependent Manner. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Y, Shi X, Numata T, Mori Y, Inoue R, Lossin C, Baram TZ, Hirose S.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 8 ページ: e80376
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0080376.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Properties of a novel GABAA receptor γ2 subunit mutation associated with seizures. (2013)
  • 著者名/発表者名: Migita K, Yamada J, Nikaido Y, Shi X, Kaneko S, Hirose S, Ueno S.
  • 雑誌名: J Pharmacol Sci 巻: 121 ページ: 84-87
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oral mexiletine for lidocaine-responsive neonatal epilepsy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakazawa M, Okumura A, Niijima S, Yamashita S, Shimono K, Hirose S, Shimizu T.
  • 雑誌名: Brain Dev. 巻: 35 ページ: 667-669
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2012.10.011
  • 査読あり
• [雑誌論文] The effect of SCN1A mutations on patient-derived GABAergic neurons: what are the implications for future Dravet syndrome therapeutics? (2013)
  • 著者名/発表者名: Higurashi N, Okano H, Hirose S.
  • 雑誌名: Future Neurol 巻: 8 ページ: 487-489
  • DOI: 10.2217/FNL.13.34
  • 査読あり
• [学会発表] Novel HCN2 mutation found in febrile seizure patients affects temperature sensitivity (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Y, Shi X, Numata T, Mori Y, Inoue R, Hirose S.
  • 学会等名: The 11th Korea-Japan Joint Symposium of Brain Sciences,and Cardiac and Smooth Muscle Sciences
  • 発表場所: Hamamatsu, Japan
  • 年月日: 20130904-20130907
• [学会発表] Molecular basis of benign familial infantile epilepsy and related syndromes (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirose S
  • 学会等名: ３０Th international Epilepsy Congress
  • 発表場所: Montreal, Canada
  • 年月日: 20130623-20130627
• [学会発表] KCNQ2 and KCNQ3 abnormalities in benign neonatal epilepsy (BNE): a genetic analysis of BNE in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Ihara Y, Ishii A, Kaneko S, Hirose S, The Epilepsy Genetic Study Group Japan
  • 学会等名: ３０Th international Epilepsy Congress
  • 発表場所: Montreal, Canada
  • 年月日: 20130623-20130627
• [学会発表] Identification of ATP1A3 mutations by exome sequencing as the cause of alternating hemiplegia of childhood in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Saito Y, Mitsui J, Ishiura H, Yoshimura J, Arai H,Yamashita S, Kimura S, Oguni H, Morishita S, Tsuji S, Sasaki M, Hirose S.
  • 学会等名: ３０Th international Epilepsy Congress
  • 発表場所: Montreal, Canada
  • 年月日: 20130623-20130627
• [学会発表] Frequency of Mutations of KCNQ2 and KCNQ3 in Benign Neonatal Epilepsy in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirose S, Ihara Y, Ishii A.
  • 学会等名: Korean Epilepsy Congress 2013
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 20130613-20130615
• [学会発表] KCNQ2 Mutation Enhances Firing Activity of Gabaergic Interneurons in the Hippocampus of Neonatal Mice (2013)
  • 著者名/発表者名: Uchida T, Deshimaru M, Koyama S, Yanagawa Y, Hirose S.
  • 学会等名: Korean Epilepsy Congress 2013
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 20130613-20130615
• [学会発表] Electrophysiogical Analysis of Mutant HCN Channels Found in Febrile Seizure Patients (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Y, Shi X, Numata T, Mori Y, Inoue R, Hirose S.
  • 学会等名: Korean Epilepsy Congress 2013
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 20130613-20130615
• [学会発表] A Geneic Analysis of Benign Neonatal Epilepsy in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Ihara Y, Ishii A, Kaneko S, Hirose S
  • 学会等名: International Symposium on Neonatal Seizures and Related Disorders(ISNS)The 15th Annual Meeting of Infantile Seizure Society(ISS)
  • 発表場所: Tokyo, Japan
  • 年月日: 20130412-20130414
• [図書] 遺伝学的診断マニュアル (2013)
  • 著者名/発表者名: 廣瀨伸一
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 稀少難治てんかん診療マニュアル