研究課題
基盤研究(B)
レプリソームの最重要因子のひとつであるPCNAはDNAを囲む様にリング状3量体を形成し、多数のDNA関連酵素と結合してこれを制御する。本課題は生理的条件下で試料の機能的構造を直接可視化できる電子顕微鏡を用い、レプリソームの基盤分子PCNAによる複製因子の制御機構を明らかにすることである。本年度はヘリケースHjmとPCNA及びDNAから構成される複合体の構造解析に着手した。蛋白質はPyrococcus furiosus(Pfu)の近縁種のThermococcus kodakarensis(Tko)由来のものを用いた。Thermococcus kodakarensisもPyrococcus furiosus同様に超好熱性であり、構造的に安定な蛋白質を有し、また超好性古細菌中で唯一遺伝子破壊株作成法が確立しているため、変異体実験が行いやすい利点がある。精製した個々の因子と基質のDNAを混合することで複合体を再構成した後に、ゲル濾過にて精製した。精製したTkoHjm-TkoPCNA-DNA複合体を電子顕微鏡を用いて観察し、単粒子解析法にてクラス平均像を得た。既に初期立体構造が得られているPyrococcus furiosus由来の複合体と同様の平均像が確認できたものの、PCNAやHjm単独の粒子が多数混在していることから、複合体の顕著な解離がみられ、構造解析に最適な条件を更に検討する必要性が認められた。特にPCNAの解離が確認されたため、TkoHjm-PfuPCNA-DNA複合体を同様に解析したところ、安定性に若干の改善が認められた。立体構造を解析した結果、以前得られていた構造と大変類似した初期構造が得られた。またDNAの高次構造を利用した標識を実際にPCNA-DNA複合体中のDNAの標識として使用し、高次構造によるバルク構造を、標識化複合体の2次元平均像及び再構成立体構造の両者において、明瞭に可視化することに成功した。
2: おおむね順調に進展している
予定通り3者複合体の構造解析が進行しており、また次のステージで個々の因子の全構造中での位置を同定する際に極めて有用となる分子標識法の有効性も、実際の複合体を用いて検証できており、順調に進展している。
引続き、Hjm等の複製因子、PCNA及びDNAから構成される3者複合体の構造解析を進める。得られた立体構造の分解能が十分高くなった場合には、個々の因子の結晶構造を当てはめることにより、複合体全体の原子モデルの構築を試みる。複合体の構造中の各因子の位置については、標識法等の可視化技術を積極的に取り入得れる。様々な因子を用いて複合体を再構成し、それぞれの因子について固有の、そして因子間で共通の制御機構等を立体構造を元に考察する。
現在使用している微量サンプル用液体クロマト装置を使用する際、試料を冷やしたまま精製できる様にするクロマトチャンバー、より大きなスケールのサンプルが扱える液体クロマト装置の購入に用いる。また得られた電子顕微鏡像から画像解析及び立体構造解析を行う際に必要なワークステーションを購入する。
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