クランプによるレプリソームの制御機構の機能構造連関の研究

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24370046
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 真柳 浩太 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (50418571)
• 研究分担者: 白井 剛 長浜バイオ大学, 公私立大学の部局等, 教授 (00262890) ; 大山 拓次 山梨大学, 総合研究部, 助教 (60423133)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 電子顕微鏡 / ナノバイオ / 生体分子 / 可視化 / 生物物理 / 単粒子解析 / DNA複製 / クランプ

研究実績の概要

昨年度に引続き、複製因子とクランプの複合体の構造解析を行った。本年度は複合体を形成する上で、より安定な条件をゲル濾過、画像解析、構造解析の結果から検討した。またDNA基質を変えることで受ける影響等を調べた。画像解析、構造計算に於いてはベイズ統計を用いた解析ツールを導入し、画像及び立体構造の分類をこれまでより厳密にすることで、構造、組成がヘテロな系に対応できるように計った。その結果FEN-Lig-PCNA-DNA複合体について、構成因子のほぼ全てを可視化することに成功し、結晶構造等を当てはめることで原子モデルを構築することに成功した。この他、NucS-PCNA-DNA複合体の解析を行い、分担者白井によって得られたNucS―DNA複合体の結晶構造と比較することにより、複合体モデリングツールによって構築した予想モデルを指示する平均像を得ることができた。PolDに関しては２つのサブユニットを等量含む最適な精製条件を見いだし、PCNA及びDNAとの複合体をゲル濾過によって精製した。また新たに導入した構造計算ツールは、ベイズ統計を利用するため、これまでより段違いの計算量を要する。これに対処するために６４コアのワークステーションを導入した。現在はクラスター化することで、さらに収束条件の探索の高速化を検討している。既に試験的に小規模なシステムを構築し、ほぼ予想通りに高速化されることを確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

4者複合体の解析が進展し構成因子を全て可視化することに成功した。特にDNAに関してはそのほぼ全長を可視化で来た点は注目に値する。この構造は異なる複数の複製因子をクランプ上に保持し、且つDNAも捉えた最初の例であり、切換えの機構を考える上で極めて重要である。凍結試料の解析も進行しており、進展の具合は概ね順調である。
基質の違い、変異体による差異なども明らかになってきている。更にNucS-PCNA-DNAや、PolD-PCNA-DNA等、新規の試料についても解析が開始された。

今後の研究の推進方策

現在、最も進展しており、且つ生物学的意義も高い、FEN-Lig-PCNA-DNA4者複合体の構造解析を中心に進め、複製因子の切換え機構を考察、誌上発表の準備を進める。またFEN-PCNA-DNA 3者複合体に関してもDNA、FENを更に明確に可視化する。この複合体は4者複合体の解析の重要なレファレンスであることに留まらない。既にPol-PCNA-DNA及びLig-PCNA-DNAを我々が解析しているので、本複合体を解析することで、ラギング鎖複製における重要な複合体の３つを全て解くことの意義は大変に大きいので早急に進める。またフラップの可視化においては、DNAナノ構造体による標識等も検討する。またDNA基質や複製因子の変異体によってどのように複合体形成、安定性、構造が変化するかを検討していく。

次年度使用額が生じた理由

均一な試料作成のために必要な合成DNA探索等が比較的効率良く行え、また構造解析用計算機が交渉の結果及び購入時期などにより、当初の予定より高性能なものがより低価格で購入できた。逆にプロジェクトの進行の過程で、ある程度の性能を有した実体顕微鏡が必要となり２６年度内の購入を検討したが、２７年度開始早々に購入することを決めたため、次年度使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

試料観察や電子顕微鏡の電子銃交換等のメンテナンス作業に必要な実体顕微鏡を購入する。

研究成果

• [雑誌論文] Revealing the intracellular ultrastructure of filopodia with cryo-electron tomography (2014)
  • 著者名/発表者名: Aramaki S, Mayanagi K, Aoyama K, Yasunaga T
  • 雑誌名: Microscopy 巻: 63: Suppl. 1 ページ: 133-134
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfu071
  • 査読あり
• [雑誌論文] 単粒子解析法で迫るDNA 複製フォーク複合体の機能構造連関 (2014)
  • 著者名/発表者名: 真柳浩太
  • 雑誌名: 顕微鏡 巻: 49 ページ: 110-117
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clustering of 3D structure similarity based network of secondary metabolites to reveal their relationships with biological activities (2014)
  • 著者名/発表者名: Ohtana Y, Azamimi A, Altaf-Ul-Amin M, Huang M, Ono N, Sato T, Sugiura T, Horai H, Nakamura Y, Morita A, Lange KW, Kibinge NK, Katsuragi T, Shirai T, Kanaya S
  • 雑誌名: Mol. Inform. 巻: 33 ページ: 790-801
  • DOI: 10.1002/minf.201400123
  • 査読あり
• [雑誌論文] Aicardi-Goutières Syndrome Is Caused by IFIH1 Mutations (2014)
  • 著者名/発表者名: Oda H, Nakagawa K, Ade J, Awaya T, Funabiki M, Hijikata A, Nishikomori R, Funatsuka M, Oshima Y, Sugawara Y, Yasumi T, Kato H, Shirai T, Ohara O, Fujita T, Heike T
  • 雑誌名: Am J Hum Genet 巻: 95 ページ: 121-125
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2014.06.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluating prion models on comprehensive mutation data of mouse PrP (2014)
  • 著者名/発表者名: Shirai T, Saito M, Kobayashi A, Asano M, Hizume M, Ikeda S, Teruya K, Morita M, Kitamoto T
  • 雑誌名: Structure 巻: 22 ページ: 560-571
  • DOI: 10.1016/j.str.2013.12.019
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of domain chimeric L-(2S, 3S)-butanediol dehydrogenase (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimegi T, Oyama T, Ohtsuki T, Kurisu G, Kusunoki M, Ui S
  • 雑誌名: Acta Cryst F 巻: 70 ページ: 461-463
  • DOI: 10.1107/S2053230X13032755
  • 査読あり
• [雑誌論文] Purification and characterization of a protease from Isaria cicadae (2014)
  • 著者名/発表者名: Takekawa C, Nakamura K, Homma H, Oyama T
  • 雑誌名: Mushroom Science and Biotechnology 巻: 22 ページ: 74-78
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular dynamics study-guided identification of cyclic amine structures as novel hydrophobic tail components of hPPARγ agonists (2014)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Y, Gamo K, Oyama T, Ohashi M, Waki M, Matsuo K, Matsuura N, Tokiwa H, Miyachi H
  • 雑誌名: Bioorg Med Chem 巻: 24 ページ: 4001-4005
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2015.06.023
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the entire stalk region of the dynein motor domain (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa Y, Oyama T, Kamiya N, Kon T, Toyoshima YY, Nakamura H, Kurisu G
  • 雑誌名: J. Mol. Biol 巻: 426 ページ: 3232-3245
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2014.06.023
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural design and synthesis of arylalkynyl amide-type peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR γ)-selective antagonists based on the helix12-folding inhibition hypothesis (2014)
  • 著者名/発表者名: Ohashi M, Gamo K, Tanaka Y, Waki M, Beniyama Y, Matsuno K, Wada J, Tenta T, Eguchi J, Makishima M, Matsuura N, Oyama T, Miyachi H
  • 雑誌名: Eur J Med Chem 巻: 90 ページ: 53-67
  • DOI: 10.1016/j.ejmech.2014.11.017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Disordered interdomain region of Gins is important for functional tetramer formation to stimulate MCM helicase in Thermoplasma acidophilum (2014)
  • 著者名/発表者名: Ogino H, Ishino S, Oyama T, Kohda D, Ishino Y
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem 巻: 79 ページ: 432-438
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.982503
  • 査読あり
• [雑誌論文] Modification of Chimeric (2S, 3S)-butanediol dehydrogenase based on structural information (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimegi T, Mochizuki K, Oyama T, Kusunoki M, Ui S
  • 雑誌名: Protein Pept Lett 巻: 22 ページ: 226-233
  • 査読あり
• [学会発表] Architecture and Regulation Mechanism of DNA Replication Fork Complex Revealed by Single Particle Analysis (2015)
  • 著者名/発表者名: Mayanagi K
  • 学会等名: IGER International Symposium on Frontiers in Biological Research with Advanced Electron Microscope Technologies
  • 発表場所: 名古屋大学、名古屋
  • 年月日: 2015-01-15 – 2015-01-16
  • 招待講演
• [学会発表] Revealing the intracellular ultrastructure of filopodia with cryo-electron tomography (2014)
  • 著者名/発表者名: Aramaki S, Mayanagi K, Aoyama K, Yasunaga T
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第５８回シンポジウム
  • 発表場所: 九州大学、福岡
  • 年月日: 2014-11-16 – 2014-11-17
• [学会発表] 単粒子解析によるDNA複製フォーク複合体の機能構造連関の研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 真柳浩太
  • 学会等名: 京都大学放射線生物研究センターセミナー
  • 発表場所: 京都大学、京都
  • 年月日: 2014-11-07 – 2014-11-07
  • 招待講演
• [学会発表] 大豆イソフラボングルコシルトランスフェラーゼGmIF7GTの結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 桑名美貴子、楠木正巳、大山拓次、中山亨
  • 学会等名: 平成26年度日本結晶学会年会
  • 発表場所: 東京大学、東京
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [学会発表] 大豆イソフラボングルコシルトランスフェラーゼGmIF7GTの構造生物学 (2014)
  • 著者名/発表者名: 桑名美貴子、楠木正巳、大山拓次、中山亨
  • 学会等名: 第87回日本生化学会年会
  • 発表場所: 国立京都国際会館、京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] Supramolecular modeling pipeline for correlative structural analysis and rational drug-design (2014)
  • 著者名/発表者名: 白井 剛
  • 学会等名: 第５２回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター、札幌
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
  • 招待講演
• [学会発表] イントロダクション:3D遺伝学のすすめ (2014)
  • 著者名/発表者名: 白井 剛
  • 学会等名: 第86回遺伝学会年会
  • 発表場所: 長浜バイオ大学、滋賀
  • 年月日: 2014-09-17 – 2014-09-19
• [学会発表] Single particle analysis of molecular architecture of DNA replication fork complex and switching mechanism of replication factors (2014)
  • 著者名/発表者名: Mayanagi K, Kiyonari S, Nishida H, Ishino S, Fujikane R, Saito M, Kohda D, Ishino Y, Shirai T, Morikawa K, Mayanagi K, Kiyonari S, Nishida H, Ishino S, Saito M, Kohda D, Ishino Y, Shirai T, Morikawa
  • 学会等名: 18th International Microscopy Congress
  • 発表場所: Prague Czech, Republic
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-12
• [学会発表] 超分子モデリングパイプラインの構築による相関構造解析・理論創薬支援 (2014)
  • 著者名/発表者名: 白井 剛
  • 学会等名: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜、横浜
  • 年月日: 2014-06-25 – 2014-06-27
  • 招待講演
• [学会発表] 超分子モデリングパイプラインの構築 (2014)
  • 著者名/発表者名: 白井 剛
  • 学会等名: 創薬等支援技術基盤プラットフォームテクニカルセミナー2014
  • 発表場所: 名古屋大学、名古屋
  • 年月日: 2014-06-24 – 2014-06-24
  • 招待講演
• [学会発表] Molecular architecture and switching mechanism of the replication fork complex (2014)
  • 著者名/発表者名: Mayanagi K, Kiyonari S, Nishida H, Ishino S, Saito M, Kohda D, Ishino Y, Shirai T, Morikawa K
  • 学会等名: Gordon Research Conference,Three Dimensional Electron Microscopy
  • 発表場所: Girona, Spain
  • 年月日: 2014-06-22 – 2014-06-27
• [図書] Methods in Molecular Biology vol. 1200 (2014)
  • 著者名/発表者名: Ogawa T, Shirai T
  • 総ページ数: 613 (539-551)
  • 出版者: Springer
• [図書] 生命のビッグデータ利用の最前線 (2014)
  • 著者名/発表者名: 辻 敏之, 白井 剛
  • 総ページ数: 231 (225-231)
  • 出版者: シーエムシー出版
• [産業財産権] 耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法 (2014)
  • 発明者名: 上森隆司, 石野良純, 相良武宏, 石野園子, 山上健, 白井剛
  • 権利者名: 上森隆司, 石野良純, 相良武宏, 石野園子, 山上健, 白井剛
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2014-184934
  • 出願年月日: 2014-09-11