ＮＥＤＤ８修飾された癌遺伝子ガンキリンのプロテアソーム活性化による卵巣癌発生機序

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24592514
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 東辻 久子 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20402852)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: NEDD8 / 癌遺伝子 / プロテアソーム / 卵巣癌

研究概要

卵巣癌細胞株においてがん遺伝子ガンキリンとubiquitin like modifierのひとつであるNEDD8はたんぱくレベルで高発現していた。in vitro gankyrin neddylation assay（バクテリアで発現、精製したrecombinant E1, recombinant E2, NEDD8, ATP, E3としてガンキリンと複合体を形成するMDM2を使う）でガンキリンのNEDD8修飾が起こるかどうかを抗ガンキリン抗体と抗NEDD8抗体でのウエスタンブロットで検討したところ、ガンキリンはNEDD8修飾（mono-neddylationだけでなく、polyneddylationも）をうけた。Gali Pragらが2011年のEMBO journalで報告しているsynthetic biology methodをガンキリンのNEDD8化にも使ってみることにした。Affinity-tagged substrate(Gankyrin)とNEDD8、E1、E2、E3をバクテリア中でco-expressionすると、in vitro gankyrin neddylation assayと同様にガンキリンはNEDD8修飾（mono-neddylationだけでなく、polyneddylationも）をうけた。HEK293T細胞に3FLAG-tagged GankyrinとHis6-Tyg-tagged NEDD8を共発現させ、抗FLAG抗体で免疫沈降、3XFLAG peptideでelute、さらに、His-resin beadsで精製したところ、抗FLAG抗体および抗Tyg抗体でのウエスタンブロットにて、3FLAG-Gankyrinがmononeddylationおよびpolyneddylationをうけていることがわかった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

MIS2Rの遺伝子のプロモーター領域の下流にCre-recombinaseをつないだ発現ベクターを作ったところで、実験が止まっている。来年度に卵巣表面上皮細胞（ovarian-surface-epithelium, OSE）特異的にCre-recombinaseを発現するトランスジェニックマウスのラインを得るところから、実験をスタートさせることになる。その後、卵巣のノーザンブロット、抗Cre-recombinase抗体を用いた卵巣のウェスタンブロットと免疫組織化学染色により、卵巣におけるCre-recombinaseのRNAとタンパクレベルでの発現を確認する。EF1promoterの下流に、loxP-Stop-loxP cassetteを配置し、さらにその下流に、FLAG-tagged NEDD８修飾ガンキリン代替分子をつないだconstructを作製するところまでは終了しているが、来年度は卵巣表面上皮細胞特異的(OSE)にNEDD８修飾ガンキリン代替分子がコンディショナルに過剰発現するtransgenic linesを得るところから、始めることになる。これらのマウスと上記のOSE特異的にCre-recombinaseを発現するトランスジェニックマウスをcrossさせて、OSE特異的にNEDD８修飾ガンキリン代替分子を過剰発現するマウスを得る。
E1-NEDD8、E2-NEDD8、E3(MDM2)-NEDD8、NEDD8修飾ガンキリン代替分子-S6ATPase-interactionを研究するためのComplementation systemとしてVenus protein、DHFRを使用するconstructsは作製した。結合阻害物質としての有機低分子化合物のスクリーニングは来年度に行う予定である。

今後の研究の推進方策

野生型ガンキリン、NEDD８修飾されないリジン・アルギニン置換変異型ガンキリン、ガンキリンのC端部分にdi-glycine(GG)を除いたNEDD8を融合した分子（NEDD8修飾ガンキリンの代替分子）の3分子の細胞癌化能を比較する。ガンキリンの活性に対するNEDD8修飾の効果を見る。NEDD8修飾ガンキリンの活性化の機序を検討する。OSE特異的にNEDD８修飾ガンキリン代替分子を過剰発現するマウスを得る。NEDD8修飾系のE1-NEDD8、E2-NEDD8、E3(MDM2)-NEDD8、NEDD8修飾ガンキリン代替分子-S6ATPase相互作用を阻害する有機低分子化合物をスクリーニングする。
PIPであるガンキリンのNEDD8修飾が26Sプロテアソームの機能に与える影響を調べる。NEDD８修飾ガンキリンに関与するE3、DUBを同定する。新規の抗NEDD８修飾系阻害剤、NEDD8修飾ガンキリン阻害を介したプロテアソーム阻害剤と考えられる有機低分子化合物について、characterizeする。OSE特異的にNEDD８修飾ガンキリン代替分子を過剰発現するマウスの卵巣癌発生のプロセスを観察する。種々の時期の卵巣癌のgene-expression-profilesをDNA-microarrays、miRNA-microarraysの受託サービスで検討する。種々の時期の卵巣癌のタンパク質のprofileを２次元電気泳動によるproteomicsで解析する。抗NEDD８修飾系阻害剤、NEDD8修飾ガンキリン阻害を介したプロテアソーム阻害剤の効果をトランスジェニックマウスの卵巣腫瘍に直接注入して効果を検討する。

次年度の研究費の使用計画

該当なし。

研究成果

• [雑誌論文] Overexpression of gankyrin in mouse hepatocytes induces hemangioma by suppressing factor inhibiting hypoxia-inducible factor-1 (FIH-1) and activating hypoxia-inducible factor-1. (2014)
  • 著者名/発表者名: Liu Y, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Itoh K, Sakurai T, Koike K, Hirota K, Fukumoto M, Fujita J.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 432(1) ページ: 22-27
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of a novel enhancer that binds Sp1 and contributes to induction of cold-inducible RNA-binding protein (cirp) expression in mammalian cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sumitomo Y, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Liu Y, Fujita T, Sakurai T, Candeias MM, Itoh K, Chiba T, Fujita J.
  • 雑誌名: BMC Biotechnol. 巻: 12 ページ: 72-80
  • DOI: 10.1186/1472-6750-12-72
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cold-inducible RNA-binding protein (Cirp) interacts with Dyrk1b/Mirk and promotes proliferation of immature male germ cells in mice. (2012)
  • 著者名/発表者名: Masuda T, Itoh K, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Nakazawa N, Sakurai T, Liu Y, Tokuchi H, Fujita T, Zhao Y, Nishiyama H, Tanaka T, Fukumoto M, Ikawa M, Okabe M, Fujita J.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 109 ページ: 10885-10890
  • DOI: 10.1073/pnas.1121524109
  • 査読あり
• [学会発表] ACC1脂質代謝系酵素によるBRCA1のhomologous recombination の調節機序 (2013)
  • 著者名/発表者名: 東辻宏明、東辻久子
  • 学会等名: 日本消化器病学会
  • 発表場所: 鹿児島市
  • 年月日: 20130321-20130323