ＮＥＤＤ８修飾された癌遺伝子ガンキリンのプロテアソーム活性化による卵巣癌発生機序

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24592514
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 東辻 久子 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20402852)
• キーワード: NEDD8 / ガンキリン / プロテアソーム / 卵巣癌

研究概要

卵巣癌でgankyrinとNEDD8は蛋白レベルで高発現。抗gankyrin抗体を用いた卵巣癌のwestern blotにより内因性gankyrinと8.5kDaのNEDD8一個分が加わったmonoNEDD8化gankyrinの二本のバンドが検出された。monoNEDD８化修飾されたgankyrinは卵巣癌で過剰発現。HEK293T細胞（APPBP1,UBA3、UBC12、NEDD8、MDM2は発現）にgankyrinとHis6 NEDD8 を強発現してHis6-tagged蛋白をguanidine-HCl、Ureaで溶解してNi+-NTA-resinで精製し、抗gankyrin抗体、抗NEDD8抗体でwestern blotすると、monoNEDD8化gankyrinが確認された。in vitro gankyrin neddylation assay（recombinant APPBP1, UBA3, UBC12, NEDD8, ATP, MDM2をtube内で反応）でもgankyrinはmonoNEDD8化修飾をうけた。bacteria内でubiquitylation cascadeをreconstituteするsynthetic biology method(Gali Prag)を用いてRosetta BL21にGST- gankyrin、UBC12、MDM2をpGST-par2 plasmidでpolycistronicに発現、もうひとつのpHIS-par2 plasmidにNEDD8、APPBP1、UBA3をpolycistronicに同時発現させるとgankyrinはmonoNEDD8化修飾をうけた。gankyrinのmonoNEDD8化修飾されるlysine残基を決定した。HEK293Tの系を用いて、gankyrinのlysineをarginineに変異させた3HA-human gankyrin(16個のlysine残基)でのmonoNEDD8化をみた。N端から１１番目のlysine残基がmonoNEDD8化。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

MIS2R遺伝子のプロモーター領域の下流にCre-recombinaseをつないだ発現ベクターを作り、卵巣表面上皮細胞特異的にCre-recombinaseを発現するtransgenic mouseの作製が終了。EF1promoterの下流にloxP-Stop-loxP cassetteを配置し、その下流に3FLAG-tagged NEDD８化修飾gankyrin代替分子をつないだベクターを作製しtransgenic mouseを作製。２者のマウスをcrossさせて、OSE特異的にNEDD８化修飾ガンキリン代替分子を過剰発現するマウスを得ることになる。
卵巣癌細胞内でAPPBP1-NEDD8、UBA3-NEDD8、UBC12-NEDD8、MDM2-NEDD8、monoNEDD8化修飾gankyrin代替分子-S6ATPaseの相互作用を解析のため、protein fragment complementation assay(PCA)を施行。Complementation systemとしては、Venus protein、DHFRを使用する。そのためのconstructsは作製。結合阻害物質として有機低分子化合物を用いる。In vitroでAPPBP1-NEDD8、UBA3-NEDD8、UBC12-NEDD8、MDM2-NEDD8、monoNEDD8化修飾gankyrin代替分子-S6ATPase相互作用を阻害する有機低分子化合物をスクリーニングする。液層でこれら蛋白の結合を阻害する物質をAlpha Technologyを用いて、EnSpire multimodal plate reader（Perkin-Elmer）で測定する予定。

今後の研究の推進方策

monoNEDD８化修飾gankyrinのE3はMDM2。DUBはin vitro neddylation系にrecombinant DUBを加えて解析。卵巣表面上皮細胞特異的にmonoNEDD8化修飾ガンキリン代替分子を発現するtransgenic mouseを作製。卵巣癌のgene expression profilesをDNA microarray、miRNA microarrayで検討。卵巣癌のタンパク質のprofileを２次元電気泳動によるproteomicsで解析。抗NEDD８化修飾系阻害剤、monoNEDD8化修飾gankyrin阻害を介した抗癌剤を腫瘍に直接注入して効果検討。gankyrinの活性に対するmonoNEDD8化修飾の効果。1) p53、pRb、MDM2、p65、IkappaB、S6、FIH-1、HIF1の半減期への影響。2)細胞内での局在の変化。3) 26S proteasomeへのリクルートの度合いの変化。wt gankyrin、monoNEDD８化修飾されないlysine・arginine置換変異型gankyrin、gankyrinのC端部分にdi-glycineを除いたNEDD8を融合した分子の3種類の発現ベクターを作製。Primary rat embryonal fibroblastにactivated Ras、E1A、上記３者を単独、前二者との組み合わせでtransfect、Focus formation assayを検討。APPBP1-NEDD8、UBA3-NEDD8、UBC12-NEDD8、MDM2-NEDD8、monoNEDD8化修飾gankyrin代替分子-S6ATPase相互作用を阻害する有機低分子化合物をAlpha technoloryを用いてEnSpire multimodal plate readerでスクリーニング。protein fragment complementation assayでも解析。gankyrinのmonoNEDD8化修飾が26Sプロテアソームの機能に与える影響。

研究成果

• [雑誌論文] Overexpression of gankyrin in mouse hepatocytes induces hemangioma by suppressing factor inhibiting hypoxia-inducible factor-1 (FIH-1) and activating hypoxia-inducible factor-1. (2014)
  • 著者名/発表者名: Liu Y, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Itoh K, Sakurai T, Koike K, Hirota K, Fukumoto M, Fujita J.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 432(1) ページ: 22-27
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hypothermia protects against fulminant hepatitis in mice by reducing reactive oxygen species production. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sakurai T, Kudo M, Watanabe T, Itoh K, Higashitsuji H, Arizumi T, Inoue T, Hagiwara S, Ueshima K, Nishida N, Fukumoto M, Fujita J.
  • 雑誌名: Dig Dis. 巻: 31(5-6) ページ: 440-446
  • DOI: 10.1159/000355242
  • 査読あり
• [学会発表] ほ乳類低温ショックタンパク質Cirpは皮膚創傷治癒を促進する (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤田潤、東辻久子、東辻宏明
  • 学会等名: 第８回臨床ストレス応答学会
  • 発表場所: 松本市、信州大学医学部付属病院、大会議室
  • 年月日: 20131115-20131116
• [学会発表] Overexpression of gankyrin in mouse hepatocytes induces hemangioma. (2013)
  • 著者名/発表者名: 東辻宏明、東辻久子、藤田潤
  • 学会等名: 第２１回JDDW２０１３
  • 発表場所: 東京都品川区
  • 年月日: 20131009-20131012