| 研究課題/領域番号 |
25290036
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
阿部 幸一郎 東海大学, 医学部, 准教授 (90294123)
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| 研究分担者 |
田嶋 敦 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (10396864)
羅 智靖 日本大学, 医学部, 教授 (60230851)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 疾患モデル / 関節炎 / ミュータジェネシス / マウス遺伝学 / 実験動物学 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では自己炎症性症候群のモデルとして、ENUで誘発されたAli14とAli18の２つの変異マウス系統を用いて、それぞれの原因遺伝子間の相互作用を解析するとともに、自己炎症を引き起こす標的細胞としてマスト細胞を想定して炎症発生の分子メカニズムを解析する。最終的にはそれらの結果を分子標的薬の開発に応用することを目指している。そのため研究計画に沿って、１）各変異系統とW/Wvマウスとの二重変異マウスの解析、２）原因遺伝子産物間の相互作用解析、３）変異マウス骨髄からのマスト細胞培養とその解析を行っている。
今年度は、Ali18;W/Wvの二重変異マウスが十分に揃ったので、その表現型解析を行った。予備実験通りに、二重変異マウスでは四肢の炎症が認められなかった。これらの結果は日本実験動物学会総会において口頭発表された。しかし、昨年度に交配開始したAli14;W/Wvの二重変異マウスでは、四肢の自己炎症が発症することが明らかとなった。マスト細胞の炎症への寄与は、各系統で異なることが判明した。
Ali14とAli18の原因遺伝子産物間の相互作用を調べるために、それぞれのコーディング領域のクローニングを行った。まず、GSTタグ標識で大腸菌に発現させて、タンパク精製を試みたところ、Ali18のタンパク質は分解してしまうことがわかった。コントロールのリン酸化酵素は問題なく精製されたので、配列に依存した分解であることが予想された。現在、哺乳類培養細胞系での強制発現と精製を試みている。
変異マウス骨髄よりマスト細胞を培養するとともに、レトロウィルスベクターによる強制発現系により原因遺伝子をマスト細胞で発現させて解析を行っている。それぞれの細胞群が得られたので、刺激によるマスト細胞活性化の解析を行っている。また、それらよりRNAを抽出する作業を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
二重変異マウスの解析において表現型の同定までに3ヶ月程度は要するため、飼育スペースの制限によって研究計画が遅れていたが、今年度はそれらの課題がクリアされて二重変異マウスの表現型に関する解析が進展した。これらの結果を学会で発表することができた。ただ、タンパク質の精製に関しては、原因遺伝子の配列に依存して分解が起こるようなので、いくつかの方法を順次試行する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究実績の概要に挙げた項目に関しては計画に沿って進んでいるが、Ali18はマスト細胞に依存して自己炎症が起こるが、Ali14に関してはマスト細胞に依存しないことが明らかになりつつある。この場合、マスト細胞におけるシグナル伝達経路が異なる可能性が考えられる。その場合、それぞれの経路を個別に解析し、必要ならばそれぞれの経路がクロスするような分子を探索する必要性がある。まずは、発現解析を行って、ある程度のおおまかな情報を得ることが先決であると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度より二重変異マウス作製の交配に遅れがあったため、マウス飼育委託費が予想を下回った。今年度は交配がだいぶ進んだが、さらに別系統の二重変異マウスの交配を進めている。しかし、こちらは雄の生殖能が低いため、予想通りに交配が進んでいない。さらにマスト細胞の培養が進捗したものの、マイクロアレイ解析を含めたそれらの発現解析は進んでいない。これらの理由より次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
二重変異マウスの交配は順調に進んでおり、今年度はさらに飼育委託費の増大が見込まれる。さらに、培養マスト細胞からのRNA抽出が可能となったので、マイクロアレイの購入を予定している。さらに故障したオートクレーブの買い替えや計画書に記載したゲル撮影装置の購入を予定しており、残額を消化する計画に問題はないと考えられる。
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