無細胞蛋白質アレイによる炎症カスパーゼ基質シグナル伝達分子の網羅的同定と解析

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25290077
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: カスパーゼ / 無細胞タンパク質合成 / プロテオリシス / タンパク質 / 切断 / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / 炎症

研究概要

I．カスパーゼ１により切断されるシグナル伝達タンパク質（sTMPおよびPK）の探索
１） sTMPおよびPKプロテインアレイの構築
申請者らが３年間費やして構築した約１０００種類のシグナル伝達タンパク質cDNAクローン［３００種類のプロテインキナーゼ（PK）および７００種類の１回膜貫通領域タンパク質（sTMP）］を用いて、Ｎ末端にFlagタグ、C末端にビオチン化した組換えプロテインアレイ（NCタグプロテインアレイ）を合成し、超低温フリーザーに保存することができた。また、一部については、従来既に確認している様に、カスパーゼ３で切断されることを確認した。これにより、合成したプロテインアレイは基質として十分機能することがわかった。
２）カスパーゼ１により切断されるシグナル伝達タンパク質の検出
上記で作成したNCタグシグナル伝達プロテインアレイから、カスパーゼ１の基質として知られているインターフェロン１βを用いて、市販されているカスパーゼ１を用いて切断が検出できるかどうか調べた。その切断検出方法には、アルファスクリーン法を利用した。その結果、カスパーゼ１がインターフェロン１βの切断を示すシグナルの低下を検出することができた。この反応を従来のイムノブロット法でも確認し、カスパーゼ１の切断もアルファスクリーン法で検出できることがわかった。この事は、カスパーゼ１基質の網羅的な探索が可能な準備ができたことを意味する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通りに、カスパーゼ１の基質切断をアルファスクリーン法で検出することができたため。

今後の研究の推進方策

今後は、プロテインアレイを用いた大規模な基質探索を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Myosin phosphatase is inactivated by caspase-3 cleavage and phosphorylation of myosin phosphatase targeting subunit 1 during apoptosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki T, Katayama T, Kohama K, Endo Y, Sawasaki T.
  • 雑誌名: Mol Biol Cell. 巻: 24 ページ: 748-756
  • DOI: 10.1091/mbc.E11-08-0740
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishigami T, Abe K, Aoki I, Minegishi S, Ryo A, Matsunaga S, Matsuoka K, Takeda H, Sawasaki T, Umemura S, Endo Y.
  • 雑誌名: FASEB J. 巻: 27 ページ: 3437-3445
  • DOI: 10.1096/fj.12-222653
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nek5, a novel substrate for caspase-3, promotes skeletal muscle differentiation by up-regulating caspase activity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shimizu K, Sawasaki T.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 587 ページ: 2219-2225
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.05.049
  • 査読あり
• [雑誌論文] Suppression of DS1 phosphatidic acid phosphatase confirms resistance to Ralstonia solanacearum in Nicotiana benthamiana. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakano M, Nishihara M, Yoshioka H, Takahashi H, Sawasaki T, Ohnishi K, Hikichi Y, Kiba A.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e75124
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0075124
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cell-free based protein array technology for analyses of protein kinases and ubiquitin ligases. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sawasaki T, Takeda H, Takahashi H, Nemoto K.
  • 雑誌名: Seikagaku 巻: 85 ページ: 438-446
• [学会発表] 無細胞プロテインアレイを用いたプロテインキナーゼおよびユビキチンリガーゼの基質タンパク質探索技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也, 根本 圭一郎, 高橋 宏隆, 竹田 浩之
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 20130911-20130913
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜タンパク質解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知）
  • 年月日: 20130619-20130621
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜蛋白質の合成・精製と細胞への導入技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也、竹田 浩之
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知）
  • 年月日: 20130619-20130621
  • 招待講演
• [学会発表] 創薬等プラットフォームにおけるコムギ無細胞基盤膜蛋白質生産と高親和膜蛋白質抗体作成技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也、竹田 浩之
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: とりぎん文化会館（鳥取県）
  • 年月日: 20130612-20130614
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成技術と乳がんバイオマーカー探索
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会主催プロテオサイエンスセンター JHUPOサテライトジョイントシンポジウム
  • 発表場所: 愛媛大学総合情報メデイアセンター・メディアホール
  • 招待講演
• [学会発表] 創薬等プラットフォーム事業におけるコムギ無細胞基盤蛋白質生産支援と高親和抗体構築技術開発
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: よこはまNMR構造生物学研究会 第47回ワークショップ「創薬等プラットフォーム」
  • 発表場所: 理化学研究所横浜研究所
  • 招待講演
• [備考] CELL-FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/index.html