無細胞蛋白質アレイによる炎症カスパーゼ基質シグナル伝達分子の網羅的同定と解析

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25290077
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: カスパーゼ / 無細胞タンパク質合成 / プロテオリシス / タンパク質 / 切断 / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / 炎症

研究実績の概要

炎症に関与するタンパク質のライブラリー作成：平成25年度に引き続き、プロテアーゼ切断検出に適したＮ末端にFLAGタグ、C末端にビオチン化した炎症関連組換えプロテインアレイ（炎症関連NCタグプロテインアレイ）の作成を進めた。その結果、サイトカイン関連タンパク質を中心に約100種類の炎症関連NCタグタンパク質を合成しイムノブロットで確認したところ、Ｎ末端のFLAGタグ化、Ｃ末端のビオチン化が確認された。以上のことから、本実験により、新たに約100の基質タンパク質を追加することができた。
カスパーゼ１の基質探索：平成25年度に成功した活性型カスパーゼ1の組換えタンパク質を用いて、上記NCタグプロテインアレイを基質として反応させた。切断の検出は、昨年度に完成したアルファースクリーン法を用いた。その結果、約800種類のタンパク質の中から１種類の基質を同定することに成功した。
基質タンパク質の切断部位の同定：カスパーゼは主として、アスパラギン酸のカルボキシル基側を切断する。上記基質の切断をイムノブロット法で確認したところ、切断部位は基質タンパク質のほぼ中央に位置することが分かった。そこで、中心に位置する複数のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体を用いて解析を行ったところ切断部位の同定することができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通りに、約800種類のタンパク質の中から１種類の基質を新たに見出し、切断部位を同定することに成功したため。

今後の研究の推進方策

新たに見出した基質の細胞内での切断、炎症への関与を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] High-throughput synthesis of stable isotope-labeled transmembrane proteins for targeted transmembrane proteomics using a wheat germ cell-free protein synthesis system. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takemori N, Takemori A, Matsuoka K, Morishita R, Matsushita N, Aoshima M, Takeda H, Sawasaki T, Endo Y, Higashiyama S.
  • 雑誌名: Mol Biosyst. 巻: 11 ページ: 361-365
  • DOI: 10.1039/c4mb00556b.
  • 査読あり
• [雑誌論文] MAPK Phosphatase 5 Expression Induced by Influenza and Other RNA Virus Infection Negatively Regulates IRF3 Activation and Type I Interferon Response. (2015)
  • 著者名/発表者名: James SJ, Jiao H, Teh HY, Takahashi H, Png CW, Phoon MC, Suzuki Y, Sawasaki T, Xiao H, Chow VT, Yamamoto N, Reynolds JM, Flavell RA, Dong C, Zhang Y.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 10 ページ: 1722-1734
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2015.02.030
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In situ visualization of plasma cells producing antibodies reactive to Porphyromonas gingivalis in periodontitis: The application of the enzyme-labeled antigen method. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mizutani Y, Tsuge S, Takeda H, Hasegawa Y, Shiogama K, Onouchi T, Inada KI, Sawasaki T, Tsutsumi Y.
  • 雑誌名: Mol Oral Microbiol. 巻: 29 ページ: 156-173
  • DOI: 10.1111/mom.12052.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Involvement of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation mediated by casein kinase I-α in infectious virus production. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masaki T, Matsunaga S, Takahashi H, Nakashima K, Kimura Y, Ito M, Matsuda M, Murayama A, Kato T, Hirano H, Endo Y, Lemon SM, Wakita T, Sawasaki T, Suzuki T.
  • 雑誌名: J Virol. 巻: 88 ページ: 7541-7555
  • DOI: 10.1128/JVI.03170-13.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pctaire1/Cdk16 promotes skeletal myogenesis by inducing myoblast migration and fusion. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimizu K, Uematsu A, Imai Y, Sawasaki T.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 588 ページ: 3030-3037
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2014.05.060.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ScreenCap3: Improving prediction of caspase-3 cleavage sites using experimentally verified noncleavage sites. (2014)
  • 著者名/発表者名: Fu SC, Imai K, Sawasaki T, Tomii K.
  • 雑誌名: Proteomics. 巻: 14 ページ: 2042-2046
  • DOI: 10.1002/pmic.201400002.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of RFPL3 protein as a novel E3 ubiquitin ligase modulating the integration activity of human immunodeficiency virus, type 1 preintegration complex using a microtiter plate-based assay. (2014)
  • 著者名/発表者名: an BH, Suzuki Y, Takahashi H, Ying PH, Takahashi C, Han Q, Chin WX, Chao SH, Sawasaki T, Yamamoto N, Suzuki Y.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 289 ページ: 26368-26382
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.561662.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The apoptotic initiator caspase-8: its functional ubiquity and genetic diversity during animal evolution. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakamaki K, Shimizu K, Iwata H, Imai K, Satou Y, Funayama N, Nozaki M, Yajima M, Nishimura O, Higuchi M, Chiba K, Yoshimoto M, Kimura H, Gracey AY, Shimizu T, Tomii K, Gotoh O, Akasaka K, Sawasaki T, Miller DJ.
  • 雑誌名: Mol Biol Evol. 巻: 31 ページ: 3282-3301
  • DOI: 10.1093/molbev/msu260.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Overexpression of the PAP1 transcription factor reveals a complex regulation of flavonoid and phenylpropanoid metabolism in Nicotiana tabacum plants attacked by Spodoptera litura. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mitsunami T, Nishihara M, Galis I, Alamgir KM, Hojo Y, Fujita K, Sasaki N, Nemoto K, Sawasaki T, Arimura G.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 9 ページ: e108849
  • DOI: 10.1371/journal.pone.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The ligand binding ability of dopamine D1 receptors synthesized using a wheat germ cell-free protein synthesis system with liposomes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Arimitsu E, Ogasawara T, Takeda H, Sawasaki T, Ikeda Y, Hiasa Y, Maeyama K.
  • 雑誌名: Eur J Pharmacol. 巻: 745 ページ: 117-122
  • DOI: 10.1016/j.ejphar.2014.10.011.
  • 査読あり
• [学会発表] 大規模生化学的解析はバイオインフォマティクス解析を凌駕するか？ (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 産総研・東京大学合同 創薬等支援技術基盤プラットフォーム(PDIS)ワークショップ ～実験とバイオインフォマティクスの協奏による構造生命科学～
  • 発表場所: 産総研臨海副都心センター別館（東京都江東区）
  • 年月日: 2014-12-18
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞技術を基盤とした化合物スクリーニング (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞HTSを用いた創薬基盤技術 (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
  • 招待講演
• [学会発表] 無細胞技術を基盤とした自己抗体探索によるアンチエイジング医学のブレークスルーをめざして (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第14回 日本抗加齢医学会総会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪府大阪市）
  • 年月日: 2014-06-06 – 2014-06-08
  • 招待講演
• [学会発表] GPCR研究のためのコムギ無細胞系プロテオリポソーム技術 (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第１１回GPCR研究会
  • 発表場所: 日本科学未来館 みらいCANホール（東京都江東区）
  • 年月日: 2014-05-09 – 2014-05-10
  • 招待講演
• [備考] CELL-FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/