無細胞蛋白質アレイによる炎症カスパーゼ基質シグナル伝達分子の網羅的同定と解析

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25290077
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: カスパーゼ１ / 炎症 / 無細胞 / 蛋白質 / 基質 / プロテアーゼ / カスパーゼ

研究実績の概要

平成25・26年度で見出した新規カスパーゼ基質が細胞内でカスパーゼ１依存的に切断されるか、また切断産物が細胞内で安定に存在するかどうかの評価を研究目標とした。
HEK293TおよびJurkat細胞を用いた新規基質分子の細胞レベル解析：遺伝子導入効率が高いHEK293T細胞およびがん化T細胞であるJurkat細胞を用いて、活性化型もしくは不活性変異体カスパーゼ１と新規基質と共発現させて切断を確認した。その結果、活性化型カスパーゼ１との共発現でのみ、切断が確認できた。また、その切断はカスパーゼ１（Z-WEHD-FMK）もしくは一般的なカスパーゼ（Pan Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK）の阻害剤処理においても、切断は抑制された。さらに、新規基質の切断部位変異体は切断されなかった。興味深いことに、C末端断片が細胞内で安定に存在した。
カスパーゼ１が恒常的に活性化しているT細胞を用いた新規基質分子の細胞レベル解析：新規基質分子がT細胞で発現していることがデータベース解析で分かった。そこで、カスパーゼ１が恒常的に活性化しているT細胞を用いて、内在の新規基質遺伝子の切断を調べたところ、切断が確認され新規基質分子のC末端断片のみ検出できた。また、その切断はカスパーゼ１（Z-WEHD-FMK）もしくは一般的なカスパーゼ（Pan Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK）の阻害剤処理においても、切断は抑制された。
以上の結果より、本研究よりカスパーゼ１の新規基質分子を新たに同定することに成功した。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

27年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takeda H, Ogasawara T, Ozawa T, Muraguchi A, Jih PJ, Morishita R, Uchigashima M, Watanabe M, Fujimoto T, Iwasaki T, Endo Y, Sawasaki T.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 11333
  • DOI: 10.1038/srep11333
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Members of the Plant CRK-superfamily are Capable of trans-/auto-Phosphorylation of Tyrosine Residues. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nemoto K, Takemori N, Seki M, Shinozaki K, Sawasaki T.
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 巻: 290 ページ: 16665-16677
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.617274
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Wheat germ-based protein libraries for the functional characterisation of the Arabidopsis E2 ubiquitin conjugating enzymes and the RING-type E3 ubiquitin ligase enzymes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ramadan A, Nemoto K, Seki M, Shinozaki K, Takeda H, Takahashi H, Sawasaki T.
  • 雑誌名: BMC Plant Biology 巻: 15 ページ: 275
  • DOI: 10.1186/s12870-015-0660-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi T, Yanazawa M, ..., Sawasaki T, Iwasaki G, Nakamura Y, Nabeshima YI, Teplow DB, Hoshi M.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 巻: 112 ページ: E4465-4474
  • DOI: 10.1073/pnas.1421182112
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Functional Characterization of the Receiver Domain for Phosphorelay Control in Hybrid Sensor Kinases. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta E, Kinoshita E, Eguchi Y, Yanagihara S, Edahiro K, Inoue Y, Taniguchi M, Yoshida M, Yamamoto K, Takahashi H, Sawasaki T, Utsumi R, Koike T.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 10 ページ: e0132598
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0132598
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] コムギ無細胞系を基盤としたサイトカイン関連プロテインアレイを用いた カスパーゼ1 新規基質の探索と解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 増原 有紀, 高橋 宏隆, 桑原 誠, 山下 政克, 澤崎 達也
  • 学会等名: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 脱ユビキチン化酵素CYLDを分解し、がん化を促進するE3リガーゼの同定・解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 上松 篤史, 高橋 宏隆, 竹田 浩之, 徳永 文稔, 山田 六平, 宮城 洋平, 澤崎 達也
  • 学会等名: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] コムギ無細胞系を用いた287種類のヒトとマウスからなるE3ユビキチンリガーゼプロテインアレイの作製と生化学的解析への応用 (2015)
  • 著者名/発表者名: 高橋 宏隆, 中島 達朗, 今村 芽依, 高橋 千佳子, 澤崎 達也
  • 学会等名: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] コムギ無細胞系を基盤とした脱ユビキチン化酵素CYLDおよびOTULINの阻害剤開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山中 聡士, 高橋 宏隆, 徳永 文稔, 澤崎 達也
  • 学会等名: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] コムギ無細胞系を用いたキナーゼ基質の探索技術 (2015)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第１５回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
  • 招待講演
• [備考] CELL-FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/index.html