| 研究課題/領域番号 |
25340051
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
高田 耕司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (30179452)
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| 研究分担者 |
加藤 尚志 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (80350388)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 有害重金属 / タンパク凝集体 / カドミウム / 細胞毒性 / ユビキチン化タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度においては、継続中の研究項目であるタンパク凝集体の抽出・分画・精製および構成成分の同定を進めるとともに、新たな研究材料として安定同位体標識アミノ酸を用いた細胞培養系を導入し、時間軸の観点からタンパク凝集の現象を分析した。すなわち、SILAC(stable isotope labeling using amino acids in cell culture)のプロトコールにもとづき、腎近位尿細管由来HK-2細胞の培地に13C6 L-lysineおよび13C6 L-arginineを経時的に加えて細胞内タンパク質を標識後、カドミウム曝露の作用を分析した。SILAC法では標識アミノ酸の取り込みと競合する非標識アミノ酸を培地から除く必要があるため、牛胎仔血清（FBS）の透析処理が避けられない。そこで本実験に先立ち、カドミウムの細胞毒性に対するFBS透析処理の影響を調べたところ、血清低分子成分の喪失に伴ってHK-2細胞のカドミウム感受性が高まり、半致死濃度EC50はこれまでの70μMから65%低下した25μMに至った。一方、細胞内タンパク質の凝集もこの実験系では25μM カドミウムに12～24時間以上曝露する条件で再現され、カドミウムによる細胞死とタンパク凝集現象の関連性が支持された。本実験においては、カドミウム曝露で生じる凝集体タンパク質の13C-アミノ酸含有率は未変性タンパク質と比較して、12時間曝露では同レベル、24時間曝露では有意に低値を示した。この結果から、カドミウム曝露の初期過程では新生タンパク質を含む幅広いタンパク成分が凝集するがその後、既存タンパク質の凝集を促す方向に転換することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究代表者は平成25年4月から東京慈恵会医科大学国領校の自然科学教室生物学研究室に赴任した。この研究室は過去の研究活動において植物の生殖細胞を対象とした微細形態学の分野に注力してきたため、研究設備・実験機器に偏りがあり、本研究を実施する上で必要不可欠な細胞培養やタンパク分析用の機器類を新たに調達するなど広範な環境づくりが求められた。そのため、昨年度までに細胞培養室、生化学実験室、動物飼育室を整備して運用を開始した。また、凝集体の観察するための倒立型蛍光顕微鏡、ELISA等の定量実験に必要なマイクロプレートリーダー、凝集現象の解析に用いるリアルタイムPCR等の機器類を入手して設置した。現在までの達成度に若干の遅延が生じているのは、こうした研究環境の整備に時間を要したためである。構築した環境を十分に活用し、研究推進に努めたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度においては、論文発表のためのデータの検証を再優先とする。具体的には、カドミウムの細胞毒性を複数の評価系で検証し、毒性発現とタンパク凝集現象の相関関係の知見を強化する。凝集体の抽出・分画・精製においては、試料に残存する界面活性剤が質量分析の効率的解析の妨げになると判明したため、尿素を可溶化剤に用いた調製法に改変する。また、昨年度の検討によって、タンパク凝集の時期によって構成成分の内容が変化する可能性が示されたため、凝集過程の時間軸に着目した試料調製も実施する。構成成分の同定に関しては早稲田大学のLC-MS/MS（NanoFrontier eLD）に加えて、慈恵医大に設置されたLC-QTOF（Bruker maXis）を活用し、上述の試料について解析を進める。その際、毒性発現に関連する特徴的な凝集成分を選別するため、安定同位体標識アミノ酸を用いたSILAC法での定量的解析を導入する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
繰り返し報告したように平成25年4月から研究代表者は、東京慈恵会医科大学国領校の自然科学教室生物学研究室に赴任した。この研究室は植物の生殖細胞を対象とした微細形態学の分野に注力してきたため、設置されている研究設備・実験機器に偏りがあり、本研究を実施する上で必要な設備や機器を入手するなど広範な環境づくりが求められた。そのため、細胞培養室と生化学実験室を整備し、培養細胞のタンパク質や遺伝子を解析するための機器類の設置に時間を要した。また、新たな教育研究体制の構築にも着手し、本研究を遂行できる環境の整備に2年以上を費やしてきた。次年度使用額が生じたのは、こうしたやむを得ない背景によって計画を部分的に延期させたためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額の6割程度は、細胞培養のための試薬と器材および凝集体の抽出・分画・精製に用いる試薬と器具等の消耗品を購入するために使用する。残額は質量分析における試薬やLCカラム等の消耗品の購入、データ解析用ソフトウェアの更新および機器使用料に充当する。
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