研究課題
基盤研究(C)
多細胞社会のなかで、生命現象の進行はどのような時空間パターンで起こるのか？これらを包括的に理解することを目的に、申請者らが2008年に報告した細胞周期可視化プローブ：Fucciのノウハウを応用し、E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発をすすめた。E3ユビキチンリガーゼは、細胞の恒常性維持に必須の酵素タンパク質である。これらの基質を材料に作製される機能プローブは、個々の細胞の中で起こる生命基本現象を可視化しながら、細胞集団のHeterogeneityを時空間的に描出することを可能とする。詳細を以下に示す。１、レインボーFucciの開発の一つとして、G0を同定するFucciプローブを共同研究で開発し論文発表した。２、低酸素環境[CUL2VHL-HIF1]およびストレス環境[CUL3Keap1-Nrf2]を可視化するE3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発を進め、Fucci－S/G2/Mをマーカーとして、これらの生命現象を同時に理解するためのtricistronic vectorを構築した。現在、このtricistronic vectorをレンチウイルスのシステムにて種々の細胞に感染させ、恒常発現細胞を構築している。３、挑戦的萌芽研究(平成２４年度・１年間計画)において開発を進めたエピジェネティクス動態を可視化するプローブを引き継ぎ、改良を試みたところ、期待する機能をもったプローブが得られつつある。４、運命決定スイッチを可視化する実験系の立ち上げとして、すでに発表されたfloxタイプのFucciマウスの導入を行い、性能評価を行った。さらに、in vivo imaging に適したマウスラインの作製を共同研究で進めた(論文投稿中)。５、in vitro 3次元培養法の検討において、細胞の準備および、顕微鏡システムのセットアップを平行して進めた。
2: おおむね順調に進展している
理想的Fucciプローブ；レインボーFucciの開発においては、共同研究による論文を発表し、すでに目標を達成しつつある。運命決定スイッチを可視化する実験系の立ち上げを行う事を先行したので、E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発においては、今後スピードアップしながら、積極的に開発をすすめる予定である。エピジェネティクス動態を可視化するプローブにおいては、期待する機能をもったプローブが得られつつあるので、今後はin vitro, in vivo の両方向からの検証実験を進めていく。
E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発においては、候補プローブの作製をさらに積極的に進める。生命現象を多角的に可視化するために、複数のプローブを同時に使用するための、プローブの多色化や、局在操作を行う。非侵襲性かつ恒常的に発現する細胞の作製をすすめ、In vitro 3次元培養法を適用し、細胞個々の反応のheterogenityを可視化していく。最終的には、細胞集団の中で、幹細胞の性質を示す細胞を時空間的に描出することを目指す。
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