| 研究課題/領域番号 |
25440176
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 埼玉大学 |
|---|
研究代表者 |
原 弘志 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (00173071)
|
|---|
| 研究分担者 |
松岡 聡 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (90509283)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | 二成分制御系 / 細胞表層ストレス / 細菌リポタンパク質 / 機能ドメイン構造 / タンンパク質間相互作用 |
|---|
| 研究概要 |
Rcs 二成分制御系は，細胞質膜(グラム陰性菌内膜)のヒスチジンキナーゼ(HK)RcsCから細胞質のレスポンスレギュレーター(RR)RcsBへのリン酸転移を，内膜のホスフォトランスミッター(HPt)RcsDが仲介する多成分のリン酸リレー系で，腸内細菌の宿主体外排出時・バイオフィルム形成時などに細胞表層に加わるストレスに応答して活性化される．その活性化に，外膜リポタンパク質RcsF が必須である．内膜局在型やペリプラズム遊離型に改変したRcsFが強くRcs系を活性化することを見出し，内膜のRcsC・Dと容易に相互作用できるようになったためと解釈できることから，RcsFがRcsC・Dと直接相互作用して情報を伝達することを示唆する結果と考えている．
ペリプラズムタンパク質であるmaltose-binding protein (MBP)と融合させてペリプラズム遊離型に改変したRcsFから，N末端40残基，C末端5残基をそれぞれ欠失しても，Rcs系活性化能は残ったが，N末端40残基とC末端5残基を同時に欠失させると，活性化能は失われた．
RcsCのペリプラズム突出領域をMBPと融合させたタンパク質(MBP-RcsCperi)を発現させると，細胞表層に欠損を生じるmdoH・tolB変異によるRcs系活性化を抑制した．MBPのシグナル配列にRcsFを融合させたものから，RcsFのN末端付近にあるProline-Rich Region (PRR)を欠失させたもの(MBPss-RcsFdeltaPRR)はRcs系を強く活性化させるが，MBP-RcsCperiの同時発現によって，活性化が抑制された．これらの結果は，MBP-RcsCperiが外膜RcsF或いはMBPss-RcsFdeltaPRRに結合して，その働きをtitrate outしたためと考えられる．RcsCのペリプラズム突出領域のC末端側約2/3をMBPに融合させたタンパク質も同様のtitration効果を示した．ペリプラズム突出領域のC末端側約2/3にRcsFと相互作用するドメインがあると考えられる．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Rcs二成分制御系について，その活性化に必須の外膜リポタンパク質RcsFとヒスチジンキナーゼ(HK)RcsCの相互作用を，RcsCのペリプラズム突出領域の過剰発現によるRcsFの活性化能のtitrationという形で示唆することができた．また，その相互作用に働くドメインを，RcsFについてはC末端付近に，RcsCについてはペリプラズム突出領域のC末端側約2/3に限定することができた．
一方，RcsFとRcsCの相互作用をより直接に示す試みについては，RcsFの機能に分子内ジスルフィド結合が必要であることがわかったため，細胞質内で相互作用を検出するtwo-hybrid実験は不適切であると考え，細胞質外での相互作用検出法が必要であると判断した．二分割GFP 断片との融合タンパク質間の相互作用を蛍光で検出するBiFC（bimolecular fluorescence complementation）法の適用を検討している．大腸菌ではSec 経路で分泌されたGFP は蛍光を発しないので，融合タンパク質をTAT 経路で分泌させる工夫が必要だと考え，ベクターの構築を始めている．
|
| 今後の研究の推進方策 |
rcsC遺伝子をクローン化し，そのペリプラズム突出領域に相当する部分に欠失や挿入変異を導入し，rcsC欠損変異株でRcsCとしての機能を発揮するかどうか調べる．この実験は，RcsCのペリプラズム突出領域中でRcsFと相互作用して情報を受容するドメインを調べる意味において，MBP-RcsCperiによるtitration実験と相補的なものである．
RcsFとRcsCとの相互作用を生化学的に示すために，RcsF・RcsC・RcsDを欠損した細胞で，MBPss-RcsF∆PRRとMBP-RcsCperiを発現させ，ホルムアルデヒドによる架橋を試みる．架橋された複合体の検出には抗RcsF抗血清と抗MBP抗体を用いる(MBPss-RcsFdeltaPRRはMBPのシグナルペプチドしかもたないので抗MBP抗体には反応しない)．
TAT経路のシグナル配列を付けた二分割GFPにRcsF∆PRRとRcsCのペリプラズム突出領域を融合させたタンパク質を発現させ，ペリプラズムにおけるBiFC実験を試みる．
RcsC・Dは相似の膜貫通構造をもち，RcsCのC末端のアスパラギン酸を含むレシーバードメイン・RcsDのC末端のヒスチジンを含むホスフォトランスミッタードメイン以外の部分のアミノ酸配列が類似していることから，HKであるRcsCだけでなく，RcsDもRcsFからの情報を受容している可能性が高いと考えている．RcsDについても，クローン化してペリプラズム突出領域に相当する部分に欠失・挿入を導入する実験や，ペリプラズム突出領域をMBPに融合させてtitrationを試みる実験を行なう．RcsDもRcsFと相互作用していることを示唆する結果が得られたら，RcsDのペリプラズム突出領域についてもホルムアルデヒドによる架橋実験やBiFC実験を試みる．
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
当初，極微量分光光度計NanoDrop 2000を購入する予定を立てていた．ところが，実験室面積を半分以下に縮小する必要に迫られ，設置場所が確保できるかどうか不安が生じたために，購入を断念した．
一方，通常の分光光度計が壊れたため，更新を余儀なくされた．
極微量分光光度計NanoDrop 2000の購入を検討する．
一方，PCR用のサーマルサイクラーが壊れ，研究室には旧式のサーマルサイクラーしかないので，更新が必要である．
|
