| 研究課題/領域番号 |
25440176
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
原 弘志 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (00173071)
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| 研究分担者 |
松岡 聡 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (90509283)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 二成分制御系 / 細胞表層ストレス / 細菌リポタンパク質 / 機能ドメイン構造 / タンンパク質間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
Rcs 二成分制御系は，細胞質膜(グラム陰性菌内膜)のヒスチジンキナーゼ(HK)RcsCから細胞質のレスポンスレギュレーター(RR)RcsBへのリン酸転移を，内膜のホスフォトランスミッター(HPt)RcsDが仲介する多成分のリン酸リレー系で，腸内細菌の宿主体外排出時・バイオフィルム形成時などに細胞表層に加わるストレスに応答して活性化される．その活性化に，外膜リポタンパク質RcsF が必須である．内膜局在型やペリプラズム遊離型に改変したRcsFが強くRcs系を活性化することを見出し，内膜のRcsCと容易に相互作用できるようになったためと解釈できる．
RcsCのペリプラズム突出領域をMBPと融合させたタンパク質(MBP-RcsCperi)を発現させるとペリプラズム遊離型改変RcsFによるRcs系活性化が抑制された．これは，MBP-RcsCperiがMBPss-RcsF∆PRRに結合して，その働きをtitrate outしたためと考えられる．
ペリプラズム突出領域中央部位を欠失させたRcsCを発現させるとRcs系活性化が抑制された．これは，この部位がRcsFからの情報受容に働いていることを示唆している．
最近，Rcs系を負に制御している内膜タンパク質YrfFがRcsFと相互作用しているという報告があった(Cho et al., 2014)．YrfFのペリプラズム突出領域をMBPと融合させたタンパク質(MBP-YrfFperi)を発現させるとペリプラズム遊離型改変RcsFによるRcs系活性化が抑制された．Rcs系の活性化にはRcsFからRcsCとYrfFの両方への情報伝達が必要と考えられる．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Rcs二成分制御系について，その活性化に必須の外膜リポタンパク質RcsFと内膜タンパク質であるRcsCとYrfFの相互作用が必要であることを示唆する結果を得た．RcsCについてはそのペリプラズム突出領域の中央部位がRcsFからの情報受容に働いていることを示した．
一方，RcsFとRcsC・YrfFの相互作用をより直接に示す試みについては，RcsFの機能に分子内ジスルフィド結合が必要であることがわかったため，細胞質内で相互作用を検出するtwo-hybrid実験は不適切であると考え，細胞質外での相互作用検出法が必要であると判断した．二分割GFP 断片との融合タンパク質間の相互作用を蛍光で検出するBiFC（bimolecular fluorescence complementation）法の適用を試みている．大腸菌ではSec 経路で分泌されたGFPは蛍光を発しないので，sf(super folder)GFPを用いて，実験を始めている．ポジティブ対照としてロイシンジッパーを融合した二分割sfGFP断片で，ペリプラズムに蛍光を検出できることがわかった．
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| 今後の研究の推進方策 |
二分割したsfGFPにペリプラズム遊離型RcsFとRcsC・YrfFのペリプラズム突出領域を融合させたタンパク質をペリプラズムに発現させて，BiFCによって,
RcsFとRcsC・RcsFとYrfFの相互作用を直接的に示す．
RcsC・Dは相似の膜貫通構造をもち，RcsCのC末端のアスパラギン酸を含むレシーバードメイン・RcsDのC末端のヒスチジンを含むホスフォトランスミッタードメイン以外の部分のアミノ酸配列が類似していることから，HKであるRcsCだけでなく，RcsDもRcsFからの情報を受容している可能性が高いと考え，RcsDについても，ペリプラズム突出領域をMBPに融合させてtitrationを試みる実験を行なっている．また，RcsCのペリプラズム突出領域をRcsDのペリプラズム突出領域と差し替えて，Rcs系の活性化に働けるかどうか検討する．
BACTH(Bacrerial Adenylate Cyclase Two-Hybrid)法を用いて，YrfF・RcsC・RcsD・RcsBの細胞質内での相互作用を検出する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初，極微量分光光度計NanoDrop 2000を購入する予定を立てていた．ところが，実験室面積を半分以下に縮小する必要に迫られ，設置場所が確保できるかどうか不安が生じたために，購入を断念した．
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| 次年度使用額の使用計画 |
極微量分光光度計NanoDrop 2000の購入を再検討する．一方，PCR用のサーマルサイクラーが旧式のサーマルサイクラーを含め2台しかないので，もう1台の補充が必要であると考えている．
また，学生・院生に積極的に学会・研究会に参加させるように努め，その旅費を支給したい．
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| 備考 |
補助事業期間延長承認：平成２８年３月２２日
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