| 研究課題/領域番号 |
25460531
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
児玉 年央 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (20346133)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 腸炎ビブリオ |
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| 研究概要 |
本研究では申請者が見いだしたVopV非依存的、TDH-T3SS2依存的な下痢誘導機構を明らかにすることを目的としている。TDHは典型的なT2SS(2型分泌機構)から分泌されるシグナルペプチドを持つことから、T2SSから分泌されていると考えられている。つまり、T3SSとは別経路で分泌されたTDHがT3SS2依存的に注入されたエフェクターと何らかの協調があって、結果的にTDH、T3SS2依存的な腸管毒性を発揮していることが考えられる。
そこでまず、VopV非依存的、TDH-T3SS2依存的な下痢誘導活性にTDHの溶血活性が必要かどうかを明らかにするために、溶血活性を持たない変異TDHを発現する腸炎ビブリオ株を作製し、下痢誘導活性をウサギ腸管結紮ループ試験で評価した。その結果、溶血活性を持たない変異TDHを発現腸炎ビブリオは下痢誘導活性を失っていた。よって、VopV非依存的、TDH-T3SS2依存的な下痢誘導活性にはTDHの溶血活性が必要であることが考えられた。そこで、抗TDH抗体がTDH-T3SS2依存的な下痢誘導活性に与える影響について検討した。その結果、野生株感染の下痢誘導活性と同様に、vopV遺伝子欠損株感染による下痢誘導活性も抗TDH抗体の添加によって抑制できなかった。
次に、tdh、T3SS1、vopV遺伝子3重欠損株感染時に精製TDHを添加することでT3SS2によって注入されたVopV以外のエフェクターがTDHと協調して下痢誘導するかどうかをウサギ腸結紮ループ試験を用いて評価した。その結果、精製TDH単独投与と比較して、tdh、T3SS1、vopV遺伝子3重欠損株感染させることで、有意な下痢原性の上昇は認められなかった。現在、腸炎ビブリオ遺伝子欠損株の共感染によるTDH-T3SS2依存的な下痢誘導活性の検証を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の評価法として用いているウサギ腸管結紮ループ試験は外科的手術を伴う感染動物実験であり、安定した結果を得るために手技の熟練と多くの再現性実験が必要であった。よって、得られた結果から確かな結論を導き出すために当初の研究計画よりも多くの実験を繰り返す必要が生じたため、やや進捗が遅れた。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、平成25年度に終了することができなかったT3SS1、T3SS2遺伝子2重欠損株とtdh、T3SS1、vopV遺伝子3重欠損株もしくはtdh、T3SS1、T3SS2遺伝子3重欠損株とを共感染させた時の下痢誘導活性を評価することで、T3SS2-TDH依存的な下痢誘導活性におけるT3SS2のエフェクターの関与について検証を行う。
次にTDH依存的な下痢誘導機構に寄与する T3SS2エフェクターの同定を試みる。T3SS2エフェクターの同定は1）T3SS2エフェクター候補の中から検索を行うとともにその結果如何によっては更なる2）新規エフェクターの同定を試みる予定である。
1）T3SS2エフェクター候補の中から検索は、これまで申請者が独自に見いだした9種類の新規エフェクターと3種類の既知のエフェクターの中から同定を試みる。vopV遺伝子欠損株からこれら計12種類の遺伝子の欠損させた2重遺伝子欠損株を作製し、それらの株の下痢誘導活性をウサギ腸管結紮ループ試験を用いて評価する。さらにこれらの株にtdh遺伝子を相補した株を作製し、これらの下痢誘導活性をウサギ腸管結紮ループ試験を用いて評価し、最終的にT3SS2-TDH依存的な下痢誘導活性に寄与するエフェクターがこれらのエフェクター候補遺伝子の中に存在するかどうかを判断する。
2）新規エフェクターの同定は、培養上清のプロテオーム解析することで検討を行う。まず。エフェクターが効率よく発現する条件(胆汁を用いた発現誘導、正の転写制御因子の強発現系を用いた発現誘導)を検討し、これらの条件の中で最適な条件を決定し、T3SS2依存的新規分泌タンパク質（新規エフェクター）の同定を試みる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
キャンペーン等の値引きにより必要物品額が当初の計画より若干減額した。しかしながら、次年度使用額は620円と少額であり、この金額単独で必要物品として購入できるものがなかった。そのために必要物品を効率よく購入するために、次年度の予算と合算して使用することにした。
次年度使用額である620円は次年度予算と合算させて、実験動物の購入費にあてる予定である。
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