SPAKキナーゼ阻害薬の開発

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670406
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 内田 信一 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (50262184)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: キナーゼ阻害薬 / 高血圧

研究概要

我々はWNKキナーゼ-OSR1/SPAKキナーゼ-NaCl共輸送体というシグナル系が腎臓に存在し、その亢進が塩分感受性高血圧症を(Cell Metab 2007)、その阻害が低血圧症を(Hum Mol Genet 2009)引き起こすことを報告した。またNCC以外にも、OSR1/SPAK下流には、腎臓でのNKCC2輸送体を介したNaCl出納調節と、血管平滑筋でのNKCC1を介した血管トーヌスの調節があり、この系の阻害剤は今までにない作用機序の降圧薬として期待される。本研究では、このカスケードの中心低役割を演じているSPAKに対する直接阻害薬のスクリーニングを行う。
25年度中には、ELISAによるスクリーニング系を立ち上げ、その細かい条件制定を終了し、医科歯科大学所蔵のケミカルライブラリー2万種のスクリーニングを終了し、いくつかのシード化合物を得ることができた。それらの、細胞系での機能確認も終了し、いくつかは細胞においてもある程度の毒性は示すものの、SPAKにたいする阻害効果が確認され、動物（マウス）への投与を行い、下流のNCC,NKCC1のリン酸化が、短期的には阻害されることが判明した。今後は、誘導体展開を行い、毒性の低下と効果の持続を目指す。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

再現性と感度のよいELISAによるスクリーニング系を立ち上げることができ、それを用いて2万種の化合物スクリーニングを終了し、細胞レベル、動物レベルで有望なリード化合物を得ることができた点で、研究の進捗度は順調と思われる。
今後は、誘導体展開を積極的にすすめて、実用可能な薬剤への開発へと進む。

今後の研究の推進方策

得られたリード化合物については、SPAK以外の多種のキナーゼを用いたプロファイリングを行い、その特異性を評価する。また、キナーゼの阻害様式の検討も並行して行う。
誘導体展開を行った化合物は、ELISAの系でスクリーニングし、リードを越える親和性を見いだせたものについては、培養細胞系の評価に進み、そこでの毒性評価が許容できると判断されれば、動物（マウス）への投与を行い、血圧や腎臓でのNaCl排泄、NCCのリン酸化に対する効果を検証する。我々は、WNK-OSR1/SPAK-NCCが恒常的に活性化したヒト偽性アルドステロン症II型モデルWNKD561Aノックインマウスを保有しており、野生型マウスとともに使用することで、生体内でのSPAKキナーゼ活性阻害効果をより鋭敏に判定できると思われる。
これらのアプローチによりえられた候補化合物の構造的な共通性を検討し、構造生物学的によりよい薬剤の可能性をシミュレーションし、今後の化学物合成の戦略を練る。

研究成果

• [雑誌論文] SPAK deficiency corrects pseudohypoaldosteronism II caused by WNK4 mutation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Chu PY, Cheng CJ, Wu YC, Fang YW, Chau T, Uchida S, Sasaki S, Yang SS, Lin SH.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e72969
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0072969
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of enzyme-linked immunosorbent assays for urinary thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter (NCC) measurement. (2013)
  • 著者名/発表者名: Isobe K, Mori T, Asano T, Kawaguchi H, Nonoyama S, Kumagai N, Kamada F, Morimoto T, Hayashi M, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: Am J Physiol Renal Physiol. 巻: 305 ページ: F1374-81
  • DOI: 10.1152/ajprenal.00208
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dietary salt intake regulates WNK3-SPAK-NKCC1 phosphorylation cascade in mouse aorta through angiotensin II. (2013)
  • 著者名/発表者名: Zeniya M, Sohara E, Kita S, Iwamoto T, Susa K, Mori T, Oi K, Chiga M, Takahashi D, Yang SS, Lin SH, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: Hypertension 巻: 62 ページ: 872-8
  • DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.113.01543
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chemical library screening for WNK signalling inhibitors using fluorescence correlation spectroscopy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mori T, Kikuchi E, Watanabe Y, Fujii S, Ishigami-Yuasa M, Kagechika H, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: Biochem J. 巻: 455 ページ: 339-45
  • DOI: 10.1042/BJ20130597
  • 査読あり
• [雑誌論文] Decrease of WNK4 ubiquitination by disease-causing mutations of KLHL3 through different molecular mechanisms. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mori Y, Wakabayashi M, Mori T, Araki Y, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 439 ページ: 30-4
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.08.035.
  • 査読あり
• [雑誌論文] KLHL2 interacts with and ubiquitinates WNK kinases. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi D, Mori T, Wakabayashi M, Mori Y, Susa K, Zeniya M, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 437 ページ: 457-62
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.06.104.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phosphorylation regulates NCC stability and transporter activity in vivo. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yang SS, Fang YW, Tseng MH, Chu PY, Yu IS, Wu HC, Lin SW, Chau T, Uchida S, Sasaki S, Lin YF, Sytwu HK, Lin SH.
  • 雑誌名: J Am Soc Nephrol. 巻: 24 ページ: 1587-97
  • DOI: 10.1681/ASN.2012070742.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immunolocalization and translocation of aquaporin-5 water channel in sweat glands. (2013)
  • 著者名/発表者名: Inoue R, Sohara E, Rai T, Satoh T, Yokozeki H, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: J Dermatol Sci. 巻: 70 ページ: 26-33
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2013.01.013.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impaired KLHL3-mediated ubiquitination of WNK4 causes human hypertension. (2013)
  • 著者名/発表者名: Wakabayashi M, Mori T, Isobe K, Sohara E, Susa K, Araki Y, Chiga M, Kikuchi E, Nomura N, Mori Y, Matsuo H, Murata T, Nomura S, Asano T, Kawaguchi H, Nonoyama S, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 3 ページ: 858-68
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2013.02.024.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Treatment with 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin ameliorated symptoms of Bartter syndrome type caused by mutated Bsnd in mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nomura N, Kamiya K, Ikeda K, Yui N, Chiga M, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 441 ページ: 544-49
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.10.129.
  • 査読あり
• [学会発表] Clinical Significance of Urinary Thiazide-Sensitive Na-Cl Cotransporter (NCC) Measurement by Newly Development Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. (2013)
  • 著者名/発表者名: Isobe K, Mori T, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 学会等名: The 46th Annual meeting of American Society of Nephrology
  • 発表場所: アトランタ, アメリカ合衆国
  • 年月日: 20131107-20131110
• [学会発表] Impaired KLHL3-mediated ubiquitination of WNK4 activates OSR1 and SPAK kinases-NaCl cotransporter (NCC) signaling and causes hypertension. (2013)
  • 著者名/発表者名: Wakabayashi M, Mori T, Isobe K, Sohara E, Susa K, Araki Y, Chiga M, Kikuchi E, Nomura N, Mori Y, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 学会等名: The 46th Annual meeting of American Society of Nephrology
  • 発表場所: アトランタ, アメリカ合衆国
  • 年月日: 20131107-20131110
• [学会発表] KLHL2 interacts with and ubiquitinates WNK kinases. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi D, Mori T, Wakabayashi M, Mori Y, Susa K, Zeniya M, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 学会等名: The 46th Annual meeting of American Society of Nephrology
  • 発表場所: アトランタ, アメリカ合衆国
  • 年月日: 20131107-20131110
• [学会発表] WNK3 Regulates Blood Pressure Through the Regulation of Vascular OSR1/SPAK-NKCC1 Phosphorylation Cascade. (2013)
  • 著者名/発表者名: Zeniya M, Sohara E, Kita S, Iwamoto T, Susa K, Mori T, Oi K, Chiga M, Takahashi D, Yang SS, Lin SH, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 学会等名: The 46th Annual meeting of American Society of Nephrology
  • 発表場所: アトランタ, アメリカ合衆国
  • 年月日: 20131107-20131110
• [学会発表] Chemical library screening for WNK signaling inhibitors by using fluorescent correlation spectroscopy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mori T, Eriko K, Sohara E, Rai T, Sasaki S, Uchida S.
  • 学会等名: The 46th Annual meeting of American Society of Nephrology
  • 発表場所: アトランタ, アメリカ合衆国
  • 年月日: 20131107-20131110
• [備考] 東京医科歯科大学腎臓内科学
  • URL: http://www.tmd.ac.jp/grad/kid/kid-J.htm