遺伝子改変マウスを用いたNBS1蛋白C末ドメインによるゲノム安定化機構の解析

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26241013
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小松 賢志 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (80124577)
• 研究分担者: 小林 純也 京都大学, 放射線生物研究センター, 准教授 (30301302) ; 田内 広 茨城大学, 理学部, 教授 (70216597) ; 加藤 晃弘 京都大学, 放射線生物研究センター, 研究員 (70423051) ; 松浦 伸也 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (90274133)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: NBS1 / ドメイン解析 / クロマチン・リモデリング / 損傷乗越えDNA合成 / 相同組換え

研究実績の概要

ナイミーヘン症候群の蛋白NBS1 はC末側100アミノ酸領域で、修復蛋白MRE11以外にも、ATM、RNF20、RAD18などと結合してチェックポイント、クロマチン・リモデリング、損傷乗り越えDNA合成、アポトーシスのDNA修復調整経路を制御する。本研究はNBS1のこれら結合ドメインの役割の解析を目的とする。
マウスを用いた研究利点の一つは、交配により目的としたレポーター遺伝子の導入が可能なことである。NBS1ノックインマウスのDNA修復能を定量的に測定するために、非相同末端再結合のレポーター遺伝子pEJをROSA26座位に導入した遺伝子改変マウスを作製した。このマウスは正常に発育して、またES細胞への制限酵素I-SceIの導入により蛍光物質GFPの発現も顕著に増加した。一方、マウスとヒトではDNA修復経路が必ずしも一致しないことが指摘されるので、CHRSPR法を用いてヒトU2OS細胞のNBS1遺伝子のRAD18結合ドメインを欠失した変異細胞を作製した。驚いたことに、ヒトNBS1ノックイン細胞はマウスのRAD18結合ドメインノックイン細胞と異なり、RAD18フォーカス形成が観察された。
正常な細胞分裂には中心体が正確に2個に複製される必要があるが、放射線照射により3個以上の中心体が生じることを我々は報告した。この実験は培養細胞を用いたものであるが、母マウスに1Gy,2Gy照射した結果、マウス胎児には中心体過剰複製が原因のMultipolar分裂が高頻度に観察された。この異常は最終的に細胞死につながるので、胎児の放射線高感受性ならびにNBS1遺伝子の関与について解析を進めている。また、NBS1ノックインマウスのゲノム不安定性による放射線発がんを検証する目的で、NBS1ノックインマウスのホモ、ヘテロ、野性型の3グループの発がん実験に充分量のマウス確保のための産生を行っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ノックインマウスの解析および中心体異常と放射線発がん実験の準備も順調に進んでいる。また、平成26年度には8報の原著論文ならびに5回の招待講演（そのうち国際学会は2回）と本研究は関連研究者に興味を持って受け入れられている。

今後の研究の推進方策

マウスとヒト遺伝子では性質が異なることが指摘されたので、ノックインマウス由来細胞に加えて、最近注目されているCHRIPR法を用いてヒト細胞のノックインとの比較研究も実験テーマに加えた。

研究成果

• [雑誌論文] Wilms' tumor gene WT1 promotes homologous recombination- mediated DNA damage repair (2015)
  • 著者名/発表者名: Oji Y, Tatsumi N, Kobayashi J, Fukuda M, Ueda T, Nakano E, Saito C, Shibata S, Sumikawa M, Fukushima H, Saito A, Hojo N, Suzuki M, Hoshikawa T, Shimura T, Morii E, Oka Y, Hosen N, Komatsu K, Sugiyama H
  • 雑誌名: Mol Carcinog 巻: 未定 ページ: 未定
  • DOI: 10.1002/mc.22248
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Increased oxidative stress in AOA3 cells disturbs ATM-dependent DNA damage responses (2015)
  • 著者名/発表者名: Junya Kobayashi, Yuichiro Saito, Michiyo Okui, Noriko Miwa, Kenshi Komatsu
  • 雑誌名: Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 巻: 未定 ページ: 未定
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] BRCA1 and CtIP are Both Required to Recruit Dna2 at Double-Strand Breaks in Homologous Recombination (2015)
  • 著者名/発表者名: Hoa NN., Kobayashi J., Omura M., Hirakawa M., Yang SH., Komatsu K., Paull TT., Takeda S., Sasanuma H
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 未定 ページ: 未定
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] DNA damage signaling guards against perturbation of cyclin D1 expression triggered by low-dose long-term fractionated radiation (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimura T, Kobayashi J, Ｋomatsu K, Kunugita N
  • 雑誌名: Oncogenesis 巻: 3 ページ: e132
  • DOI: 0.1038/oncsis.2014.48
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Oliveira DV, Kato A, Nakamura K, Ikura T, Okada M, Kobayashi J, Yanagihara H, Saito Y, Tauchi H, Komatsu K (2014)
  • 著者名/発表者名: Oliveira DV, Kato A, Nakamura K, Ikura T, Okada M, Kobayashi J, Yanagihara H, Saito Y, Tauchi H, Komatsu K
  • 雑誌名: J Cell Sci 巻: 127 ページ: 763-772
  • DOI: 10.1242/jcs.135855
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ATM regulates Cdt1 stability during the unperturbed S phase to prevent re-replication. (2014)
  • 著者名/発表者名: Iwahori S, Kohmon D, Kobayashi J, Tani Y, Yugawa T, Komatsu K, Kiyono T, Sugimoto N, Fujita M.
  • 雑誌名: Cell Cycle 巻: 13 ページ: 471-481
  • DOI: 10.4161/cc.272742014
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Mutations in the FHA-domain of ectopically expressed NBS1 lead to Radiosensitization and to no increase in somatic mutation rates via a partial suppression of homologous recombination. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maki Ohara, Yumi Funyu, Shunsuke Ebara, Yuki Sakamoto, Ryota Seki, Kenta Iijima, Akiko Ohishi, Junya Kobayashi, Kenshi Komatsu, Akira Tachibana, and Hiroshi Tauchi.
  • 雑誌名: J Radiat Res 巻: 55 ページ: 690-8
  • DOI: 10.1093/jrr/rru011.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hypergonadotropic Hypogonadism and Hypersegmented Neutrophils in a Patient with Ataxia-Telangiectasia-Like Disorder: Potential Diagnostic Clues? (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T, Awaya T, Shibata M, Kato T, Numabe H, Kobayashi K, Komatsu K, Heike T
  • 雑誌名: Am J Med Genet A 巻: 164A ページ: 1830-4
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.36546
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Dose-dependent regulation of two rejoining pathways for DNA double-strand breaks. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yuichiro Saito, Makoto Ihara, Akihiro Kato, Junya Kobayashi, Kenshi Komatsu.
  • 学会等名: 30th RBC-NIRS International Symposium
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2015-02-20
  • 招待講演
• [学会発表] 相同組換え修復と損傷乗越えDNA合成におけるNBS1蛋白の役割 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小松賢志、加藤晃弘、柳原啓見、斎藤裕一朗、周慧、小林純也
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25
  • 招待講演
• [学会発表] Roles of NBS1 in radiation responses and initiation of translesional DNA synthesis (2014)
  • 著者名/発表者名: Kenshi Komatsu.
  • 学会等名: 5th US-Japan DNA Repair
  • 発表場所: 鳴門
  • 年月日: 2014-10-29
  • 招待講演
• [学会発表] NBS1蛋白C末側ドメインとDNA損傷応答における役割 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小松賢志、加藤晃弘、柳原啓見、斎藤裕一朗、周慧、小林純也
  • 学会等名: 日本放射線影響学会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 2014-10-01
  • 招待講演
• [学会発表] 紫外線損傷乗り越えDNA合成と電離放射線の修復蛋白NBS1 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小松賢志
  • 学会等名: 光医学・光生物学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-07-25
  • 招待講演
• [図書] Nijmegen Breakage Syndrome (ナイミーヘン症候群) (2015)
  • 著者名/発表者名: 加藤晃弘、柳原啓見、小松賢志
  • 総ページ数: 未定
  • 出版者: 日本臨牀社
• [備考] 京都大学放射線生物研究センター
  • URL: http://www.rbc.kyoto-u.ac.jp