研究課題
ドイツの遺伝学研究者との共同研究により、ファンコニ貧血（FA）の新規原因遺伝子を見いだした。本研究課題では仮にFANCXとする。ドメイン構造から推定されるFANCXの機能は、既存のFA経路の概念では説明できず、本研究課題によるFANCXの解析によりFA経路の新規機能を明らかにすることが期待できる。fancx欠損DT40細胞を用い、様々なDNAダメージに対する感受性テストを行った。DNAクロスリンク（ICL）薬剤であるシスプラチン、マイトマイシンC、あるいは抗がん剤であるカンプトテシン（cpt）、紫外線に対しfancx欠損細胞は高感受性を示した。一方、放射線（ガンマ線）には顕著な感受性は認められなかった。予備的な解析により、fancx欠損DT40細胞はジーンターゲティング頻度が著減していた。この結果は、相同組換え（HR）活性の低下を示唆しており、異なるHR効率測定法による検討を重ねた。まず、ゲノム上にI-SceI切断部位を持ったDT40細胞を用い、人為的にDNA二重鎖切断を導入し、その修復を検討するI-SceIアッセイを行った。fancx欠損細胞では、I-SceIアッセイで活性の減少が観察された。加えて、fancx欠損細胞では染色体断裂の出現頻度の上昇が見られた。以上の結果はいずれもFANCXがDNA修復においてHR活性制御に大きく寄与することを示唆する。続いて、FANCXがHR活性制御に関与する分子メカニズムを探るため、相互作用分子探索を行った。まず、酵母ツーハイブリッド法を用い、トリFANCXをベイトとし、トリcDNAライブラリーのスクリーニングを行ったが、有意な候補分子は得られなかった。fancx欠損細胞の表現型解析から、FANCXタンパク質のHR機能への関与が示唆されたので、次にFANCXとHR関連分子群との相互作用をほ乳類ツーハイブリッド法により検討し、FANCXとRPA複合体との相互作用を見いだした。
1: 当初の計画以上に進展している
Fancx変異細胞の詳細な表現型解析は順調に進行している。我々は主にトリDT40由来のfancxノックアウト細胞ならびにヒトU2OS由来のfancxノックダウン細胞を用い、fancx変異細胞はICL薬剤への高感受性、染色体断裂などのヒトFA患者に典型的な表現型を示すことを確認した。さらに解析を進め、fancx欠損細胞はDNA修復のHR経路の機能が著減していることを見いだし、FANCXがDNA修復のHR活性制御に重要な貢献をしていることが明らかになってきた。また、予備的な解析では、これらの活性にはFANCXのユビキチンE3リガーゼ活性を担うRINGドメインが重要であり、ヒトFA患者に相当するトリFANCX変異体では活性の減少を観察している。加えて、FANCXとRPA複合体の相互作用を見いだした。これは、fancx欠損細胞の示すHR活性低下の分子メカニズム解明の手がかりとなる重要な知見であり、FANCXがRPA複合体を介してHR機能を制御する仮説を考え検証を進める。
１．fancx変異細胞の表現型解析。平成26年度に引き続き行う。我々は、主にトリDT40由来のfancxノックアウト細胞ならびにヒトU2OS由来のfancxノックダウン細胞を用い、fancx変異細胞はDNAクロスリンク薬剤への高感受性、染色体断裂などの典型的なFAの表現型を示すことを確認した。さらに、fancx欠損細胞はDNA修復のHR経路の機能が著減していることを見いだした。FANCXのHR経路への関与を明らかにするため、他のHR機能の検定系でも詳細に検討する。具体的には、姉妹染色分体交換（SCE）頻度の測定などを行う。主にfancx欠損DT40細胞を用い、FANCXの機能ドメインの変異体やヒトFA患者変異に相当するトリFANCX変異体を使用し、FANCXの機能と構造の関連を明らかにする。２．FANCXによるHR経路制御の分子メカニズムの解明。平成26年度の検討で、FANCXとHR経路分子の相互作用を検討し、FANCXとRPA複合体の相互作用を見いだした。RPA1, RPA2やFANCXの変異体を用い、RPA1, RPA2とFANCXの相互作用領域を明らかにする。また、FANCXとRPA複合体の相互作用が、RPAを介してHR機能を制御するとの仮説を考え、検証を進める。FANCX, RPA1, RPA2はリン酸化、ユビキチン化などの翻訳後修飾が知られており、これらの分子修飾とHR機能に与える影響との連関を手始めに検討を行う。
研究は順調に推移している。特にFANCXの分子作用メカニズムについて、想定よりも早く標的候補分子のメドがたったため、研究対象を絞り込むことができ、初年度の研究費に余裕が生じた。
主に、消耗品に使用する。
http://house.rbc.kyoto-u.ac.jp/late-effect
すべて 2014
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (2件) (うち招待講演 2件)
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