| 研究課題/領域番号 |
26291013
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
児嶋 長次郎 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (50333563)
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| 研究分担者 |
藤原 敏道 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20242381)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | NMR / 蛋白質 / 立体構造 / in situ |
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| 研究実績の概要 |
本研究は生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定する NMR 技術の開発を目的とする。具体的には、生きている細胞で観測したい蛋白質のみを領域選択的かつアミノ酸選択的に安定同位体標識して NMR 信号を帰属する技術や、細胞内で安定な還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いた新規 NMR 測定解析技術を開発し、阪大蛋白研が開発・整備を進めてきた高磁場 DNP 法など世界最先端の NMR 技術・装置と組み合わせることで、生きている細胞のままで蛋白質の立体構造を決定する技術を確立することを目指している。
平成26年度は、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術を開発した。具体的には、目的「外」蛋白質の翻訳を完全に阻害できる SPP システム(配列特異的な RNA 切断酵素を共発現させる低温発現系)を用い、目的「外」蛋白質の標識を完全に抑制する技術の開発に成功した。また、SPP システムとアミノ酸要求性株とを組み合わせ、大腸菌の系でアミノ酸選択的な標識技術の開発に成功した。さらに、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いた NMR 測定解析技術を開発した。具体的には、細胞内で利用可能な還元耐性を持つスピンラベル試薬を用い、マレイミド基を介して不可逆的にスピンラベルをシステインに導入し、常磁性緩和促進(PRE)法によって立体構造情報を得ることに成功した。また、目的蛋白質の N 末端選択的に還元耐性を持つキレート試薬を導入し、キレート試薬とランタニド金属を用いた偽コンタクトシフト(PCS)法によって立体構造情報を得ることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は平成２６年度より平成２８年度まで実施する。平成２６年度は計画どおり研究が進捗し、平成２６年度に計画していた研究目的は概ね達成できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は平成２６年度より平成２８年度まで実施する。平成２６年度は計画どおり研究が進捗したため、平成２７年度は当初の計画どおり研究を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
適任者が見つからず、研究補助員が雇用できなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究補助員の雇用に充てる。
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