In situ 蛋白質 NMR 構造解析技術

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26291013
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 児嶋 長次郎 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (50333563)
• 研究分担者: 藤原 敏道 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20242381)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: NMR / 蛋白質 / 立体構造 / in situ

研究実績の概要

本研究では生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定するNMR技術の開発を目的とする。具体的には、生きている細胞で観測したい蛋白質のみを領域選択的かつアミノ酸選択的に安定同位体標識してNMR信号を帰属する技術や、細胞内で安定な還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いた新規NMR測定解析技術を開発し、阪大蛋白研が開発・整備を進めてきた高磁場DNP法など世界最先端のNMR技術・装置と組み合わせることで、生きている細胞のままで蛋白質の立体構造を決定する技術を確立することを目指している。
平成27年度は、平成26年度から継続して、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発と、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発、を進めるとともに、(3)生きている細胞のままでのNMR信号の帰属法の確立と、(4)生きている細胞のままでのNMR立体構造情報の収集を試みた。具体的には、アミノ酸選択的な安定同位体標識では、主鎖15N標識がメチル基選択的13C標識より効率的な信号帰属が可能なことを明らかにするとともに13C/15N以外の安定同位体標識に成功した。キレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発においては、pH依存的な構造情報を得ることに成功した。さらに、生きている細胞のままでのNMR信号の一部帰属にも成功した。帰属法の確立と立体構造情報の収集では、標識蛋白質の細胞導入において技術的問題点があったが、その問題も電気穿孔法を用いることでおおむね解決できた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成27年度に実施した研究項目、(3)生きている細胞のままでのNMR信号の帰属法の確立と、(4)生きている細胞のままでのNMR立体構造情報の収集、において、やや進捗に遅れが出た。しかし、平成26年度から継続して実施している研究項目、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発と、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発、において、当初予定以上の進捗があった。このため、全体としては、おおむね順調に進展していると評価できる。

今後の研究の推進方策

平成27年度にやや進捗に遅れが出た研究項目、(3)生きている細胞のままでのNMR信号の帰属法の確立と、(4)生きている細胞のままでのNMR立体構造情報の収集、に注力するとともに、当初予定以上に進捗があった研究項目、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発と、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発、の成果を積極的に用いることで、最終的な目標達成を目指す。

次年度使用額が生じた理由

(1)予定していた一部消耗品の購入が不要となったため、消耗品に残額が発生した。
(2)予定していた成果報告を日程の都合で取りやめたため、旅費が未使用となった。
(3)予定していた論文投稿が遅れたため、英文校正のための謝金およびその他の費目が未使用となった。

次年度使用額の使用計画

(1)研究計画を拡充し、主に消耗品を追加購入する。
(2)旅費、(3)謝金およびその他、は当初計画通り。

研究成果

• [国際共同研究] IOCB AS CR(チェコ)
  • 国名: チェコ
  • 外国機関名: IOCB AS CR
• [雑誌論文] 1H, 15N and 13C resonance assignments of the conserved region in the middle domain of S. pombe Sin1 protein (2015)
  • 著者名/発表者名: Saori Kataoka, Kyoko Furuita, Yoshikazu Hattori, Naohiro Kobayashi, Takahisa Ikegami, Kazuhiro Shiozaki, Toshimichi Fujiwara, and Chojiro Kojima
  • 雑誌名: Biomol. NMR Assign. 巻: 9 ページ: 89-92
  • DOI: 10.1007/s12104-014-9550-6
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Direct Detection of the Mercury-Nitrogen Bond in the Thymine-HgII-Thymine Base-pair with 199Hg NMR Spectroscopy (2015)
  • 著者名/発表者名: Takenori Dairaku, Kyoko Furuita, Hajime Sato, Jakub Sebera, Daichi Yamanaka, Hiroyuki Otaki, Shoko Kikkawa, Yoshinori Kondo, Ritsuko Katahira, F. Matthias Bickelhaupt, Celia Fonseca Guerra, Akira Ono, Vladimir Sychrovsky, Chojiro Kojima, and Yoshiyuki Tanaka
  • 雑誌名: Chem. Commun. 巻: 51 ページ: 8488-8491
  • DOI: 10.1039/c5cc02423d
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Physicochemical natures of interfaces control activity of ferredoxin NADP+ reductase through its interprotein interactions with ferredoxin (2015)
  • 著者名/発表者名: Misaki Kinoshita, Ju yaen Kim, Satoshi Kume, Yukiko Sakakibara, Toshihiko Sugiki, Chojiro Kojima, Genji Kurisu, Takahisa Ikegami, Toshiharu Hase, Yoko Kimata-Ariga, and Young-Ho Lee
  • 雑誌名: BBA - Bioenergetics 巻: 1847 ページ: 1200-1211
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2015.05.023
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Exploring a DNA sequence for 3-dimensional structure determination of a silver(I)-mediated C-C base pair in a DNA duplex with 1H NMR spectroscopy (2015)
  • 著者名/発表者名: Takenori Dairaku, Kyoko Furuita, Hajime Sato, Yoshinori Kondo, Chojiro Kojima, Akira Ono, and Yoshiyuki Tanaka
  • 雑誌名: Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 巻: 34 ページ: 877-900
  • DOI: 10.1080/15257770.2015.1088160
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] PRE and PCS techniques utilized for high-resolution protein structure determination (2015)
  • 著者名/発表者名: Chojiro Kojima
  • 学会等名: The 2015 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies
  • 発表場所: Sheraton Waikiki (Honolulu)
  • 年月日: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] NMR tools developed for drug discovery (2015)
  • 著者名/発表者名: Chojiro Kojima
  • 学会等名: International Symposium on Structure and Folding of Disease Related Proteins
  • 発表場所: Seoul National University (Seoul)
  • 年月日: 2015-12-04 – 2015-12-05
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Utilization of Paramagnetic NMR techniques for protein structure determination (2015)
  • 著者名/発表者名: Chojiro Kojima
  • 学会等名: The 6th Asia-Pacific NMR Symposium
  • 発表場所: The Hong Kong University of Science and Technology (Hong Kong)
  • 年月日: 2015-08-13 – 2015-08-16
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Paramagnetic NMR techniques utilized for protein structure analysis (2015)
  • 著者名/発表者名: Chojiro Kojima
  • 学会等名: The 3rd Awaji International Workshop on “Electron Spin Science & Technology: Biological and Materials Science Oriented Applications”
  • 発表場所: The Awaji Yumebutai International Conference Center (Awaji)
  • 年月日: 2015-06-14 – 2015-06-17
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Drug screening using NMR to regulate protein function (2015)
  • 著者名/発表者名: Chojiro Kojima
  • 学会等名: The First Trilateral Workshop For Frontier Protein Studies
  • 発表場所: Peking University (Beijing)
  • 年月日: 2015-04-23 – 2015-04-25
  • 国際学会 / 招待講演