| 研究課題/領域番号 |
26293129
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
植田 正 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (90184928)
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| 研究分担者 |
白石 充典 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (00380527)
阿部 義人 九州大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (60315091)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 神経障害性疼痛 / 抗体工学 / P2X4受容体 |
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| 研究実績の概要 |
神経障害疼痛モデル動物に発現するP2X4受容体量をイメージングすることを目的として、平成27年度までラットP2X4受容体に強く結合するモノクローナル抗体を5種類（抗体の超可変部位の一次配列を解析により異なる配列であることと確認済）作成した。
平成28年度は、まず、これらモノクローナル抗体とラットP2X4受容体ヘッドドメイン（HD）との相互作用を表面プラズモン共鳴法ならび滴定型熱量計により評価した。いずれの抗体もHDとの複合体の解離定数は10から数十nMであった。結合の熱力学を解析したところ、４種の抗体はエントロピーならびにエンタルピー支配的に結合したが、１種の抗体はエントロピー的に不利な抗体もあった。培養細胞(1321N1)に発現したP2X4受容体に対して、5種の抗体の結合を評価した。１種の抗体のみ非常に強く結合した。その抗体を使って、ラットの脳ミクログリアの初代培養細胞を用いてイメージングを行った。その結果、ラットP2X4発現細胞を特異的に染色できていることがわかった。
ラット生細胞由来のP2X4受容体は培養細胞由来のそれに比べ、SDS-PAGEで解析すると見かけ上の分子量が大きいことから、糖鎖の付加の程度が大きいことが予想される（変性しているP2X4受容体に特異的に結合する抗体を使って評価）。バックアップ実験として計画していた、N型糖鎖を切断するEndo-F処理（SDS-PAGEの解析から見かけ上の分子量は小さくなっていることを確認）をした培養細胞由来P2X4受容体に対して、５種の抗体の結合を評価した。糖鎖処理前後の抗体の結合力は同程度であった。培養細胞由来のP2X4受容体に結合しているN型糖鎖の有無は、これらの抗体の結合には影響しないことがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度のマイルストーンとして、ラットP2X4受容体発現細胞をイメージングするモノクローナル抗体を得ることであった。P2X4受容体と抗体の複合体の解離定数が数十nM程度の抗体を得ることに成功し、ラットP2X4受容体発現培養細胞、ミクログリア初代培養細胞において、P2X4受容体をイメージングできた。これらの結果はマイルストーンに到達しているので、概ね順調に研究計画が進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度まで、ラットP2X4受容体と抗体の複合体の解離定数が数十nM程度のモノクローナル抗体を得ることに成功し、ラットP2X4受容体発現培養細胞、ミクログリア初代培養細胞において、P2X4受容体をイメージングできた。今後は、研究の最終目的である神経障害性モデルラットの疼痛発生時のP2X4受容体の発現について、脊髄を動物から取り出して病理診断ができるかどうかを評価する。また、P2X4受容体に強く結合する抗体及びFabを蛍光ラベル化して、動物へ硬膜外投与することにより、in vivoでP2X4受容体の発現をイメージングできるかどうかを評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度は九州大学薬学研究院の動物実験施設において、感染事故等が発生し、動物実験が数ヶ月間実施できなかった。モノクローナル抗体を作成する実験ができなかったため、実験に関わる物品費が未使用となった。そのモノクローナル抗体を使用して、連携研究者に実験動物を使用した実験を依頼する予定であったが、同様な理由で実施が困難であった。このような理由により残額が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
モノクローナル抗体の作成が遅れたため、当初研究代表者の研究室で自ら動物を利用してモノクローナル抗体を調製する予定であったが、研究を加速するため、昨年度未使用経費を用いてモノクローナル抗体を外注する。併せて費用はかかるが比較的短時間でモノクローナル抗体を調製できる培養細胞を用いて抗体を得る。さらに、研究補助員の雇用期間を当初予定より延長する経費にあて、研究を加速する。
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