| 研究課題/領域番号 |
26293129
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
植田 正 九州大学, 薬学研究院, 教授 (90184928)
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| 研究分担者 |
白石 充典 九州大学, 薬学研究院, 助教 (00380527)
阿部 義人 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (60315091)
日下部 宜宏 九州大学, 農学研究院, 教授 (30253595)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 神経障害性疼痛 / P2X4受容体 / 抗体工学 / 痛みの定量 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までにラットP2X4受容体に対して強く結合する抗体を調製した。今年度は本研究計画の最終目的である、ラットの障害性疼痛時に発現するP2X4受容体をin vivoイメージングすることを目的として実験を行った。まず最初に、ラットP2X4受容体の細胞外のヘッドドメインに強く結合するモノクローナル抗体（12-10Hと記す）を無血清培地を用いた細胞培養により、発現する系を確立した。並行して、共同研究者（日下部）の専門領域であるカイコ発現系を用いて、抗P2X4リコンビナントFabの調製を行った。
カイコ発現系ではリコンビナントFabを高発現できなかったので、無血清培地を用いた細胞培養から得たサンプルを用いて以下の実験を実施した。12-10H（抗原-抗体複合体の解離定数は十数nM）を蛍光ラベル化した。ネガティブコントロールとして、無血清培地を用いた細胞培養で調製したニワトリ卵白リゾチームに対する抗体（確立済：LKS103と記す）を蛍光ラベル化した。
P2X4受容体発現した1321N細胞を用いて、これらの蛍光ラベル化抗体の結合について定量実験を行った。P2X4受容体発現1321N細胞には12-10Hのみ結合し、LKS103には結合しなかった。この結果から、P2X4受容体に12-10Hが特異的に結合することがわかった。25μg/mlの抗体（12-10H）の濃度で、優位差を持ってこの受容体を染色できた。
次に、ラット新生児の脳からミックスグリアカルチャーを作成し、２日おきに培地交換し、22日後にミクログリアを単離した。プラスチック製培養皿上に付着している細胞を剥がして懸濁したものを、40μg/mlの抗体(12-10H)の濃度でFACS assayを行った。12-10Hの抗体ありと抗体なしを比較した結果、細胞カウントが最大時の蛍光強度の違いは約5倍程度であったが、統計的には優位ではなかった。
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| 現在までの達成度 (段落) |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 次年度使用額の使用計画 |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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