| 研究課題/領域番号 |
26293328
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
岡田 尚巳 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (00326828)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 脳神経疾患 / ウィルスベクター / 遺伝子治療 |
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| 研究実績の概要 |
（1）高規格AAVベクター製造法の開発：大規模製造に適したプロトコルを検証し効率化を推進した。293EB細胞への導入効率の改善とSOP作業手順の安定を目的として、linear PEIを用いたベクター産生至適条件を検討した。また、SOPの支障となる塩化セシウム超遠心を省略した高規格精製に向け、陰陽イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを組み合わせ、精製効果を検証した。
（2）脳神経疾患における新規遺伝子導入法とタンパク質補充療法：脳組織への外来遺伝子導入法として、マイクロバブル併用超音波照射を応用し、関心領域あるいは広範囲脳組織への導入条件を検証した。マーモセット静脈内にエバンスブルー色素とマイクロバブルをボーラス投与し、同時に2W、1MHzの超音波を2ないし10分間、頭皮上から内側側頭葉や頭頂葉を標的として照射した。還流固定後、各々の組織中の色素量をホルムアミド抽出にて吸光度で評価した。また、炎症制御治療ベクターとして、将来GMP化が可能な構造のIL-10発現AAVベクターを構築し、機能を確認した。MSCや歯髄由来幹細胞についても拡大培養を行い条件検討を行った。炎症を伴う脳血管障害の疾患モデルとして、MCA閉塞SDラットを作成し、TTC染色にて梗塞体積の評価を行った。
（3）ベクター産生型標的細胞によるin situ遺伝子治療：MSCや歯髄由来幹細胞を応用したベクター産生型細胞を構築するための条件検討を行った。ルシフェラーゼ発現ベクターのコンポーネントを歯髄由来幹細胞に導入し、培養細胞の系でベクター産生および遺伝子発現量を評価した。ベクターのコンポーネントの比率、高い産生量を維持する至適条件を検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
従来の精製法における密度勾配超遠心操作はGMP生産において不利な操作段階であったが、イオン交換やゲル濾過クロマトグラフィーを応用し、密度勾配超遠心操作を省略可能なウイルス精製プロトコルの作成と再現に成功した。製造したベクターを用いた遺伝子導入試験を行い良好な遺伝子発現が確認された。GMP生産への応用を推進すると同時に、純度の高いベクターを応用することで、脳組織への遺伝子導入や脳神経疾患の治療実験において、安全に長期間の効果が期待できる。また、MSCに加え歯髄由来幹細胞についても、ベクターコンポーネントの導入条件が検証できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回開発した密度勾配超遠心操作を省略可能なウイルス精製プロトコルを応用し、より大規模での試験製造を実施することで、GMP製造に向けた課題を検証する。また、カプシドに親和性の高いアプタマーの網羅的スクリーニングを行い、アフィニティー精製に応用可能な担体の開発を進める。純度の高いベクターを応用することで、脳組織への遺伝子導入や脳神経疾患の治療実験において、安全に長期的効果が期待できる。また、MSCに加え歯髄由来幹細胞についても、ベクターコンポーネントの導入とベクター産生条件を検証することで、癌や炎症性疾患の治療実験を推進する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
密度勾配超遠心操作を省略可能なウイルス精製プロトコルの作成が、予想以上に順調に進行した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今回開発した密度勾配超遠心操作を省略可能なウイルス精製プロトコルを応用し、より大規模での試験製造を実施することで、GMP製造に向けた課題を検証する。また、カプシドに親和性の高いアプタマーの網羅的スクリーニングを行い、アフィニティー精製に応用可能な担体の開発を進める。
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