| 研究課題/領域番号 |
26293374
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
吉田 茂生 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363370)
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| 研究分担者 |
石橋 達朗 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30150428)
中尾 新太郎 九州大学, 大学病院, 助教 (50583027)
佐々 由季生 福岡大学, 医学部, 講師 (80580315)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 脈絡膜増殖組織 / ペリオスチン |
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| 研究実績の概要 |
眼内増殖性疾患の増殖組織を用いたゲノムワイドのマイクロアレイ・EST解析によってすでに抽出された活動性増殖組織特徴遺伝子群のうち、マトリセルラー蛋白であるペリオスチンを標的とし、RNA干渉を用いてその発現を抑制する新規1本鎖核酸医薬(NK0144)の脈絡膜増殖組織形成抑制効果を検討した。
In vitroのアッセイ系を脈絡膜増殖組織においてペリオスチンを産生している主な細胞と考えられる培養ヒトRPE細胞を用いて行った。TGFβ2刺激によるペリオスチン発現増幅下で亢進するRPE細胞の増殖、接着、遊走それぞれをNK0144により抑制出来るかを検討した。NK0144によりRPE細胞の増殖、接着、遊走がそれぞれ有意に抑制された。
In vivoではマウスレーザーCNVモデルを用いてNK0144の脈絡膜増殖組織に対する作用を検討した。CNVモデルではレーザーによる血管新生誘導後にペリオスチンの発現が増大し、レーザー後14日目で発現が最大となった。またその発現は蛍光免疫染色でRPE細胞と共染することを確認した。ペリオスチンノックアウトマウスではレーザーにより誘導された初期のCNV、後期の脈絡膜線維組織ともに野生型に比べて減少しておりペリオスチンが脈絡膜増殖組織形成を促進していると考えられた。このモデルにFITCで標識したNK0144を硝子体内投与したところ、投与後24時間からRPE細胞への到達を認め、少なくとも120時間までは残存していることを確認した。また、NK0144はこのモデルにおけるRPE細胞のペリオスチン発現を有意に抑制していることも確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
in vitroでは培養ヒトRPE細胞、in vivoではマウスレーザーCNVモデルを用いた脈絡膜増殖組織に対するペリオスチンを標的とした新規1本鎖核酸の効果と安全性に関する検討はすでに終了しており、良好な結果を得ることが出来ている。国内、国際学会で発表を行い、論文発表まで初年度で行うことが出来た。網膜前血管増殖に関する新規1本鎖核酸の効果に関する解析も進行中であり、今年度も論文発表までを目標とし順調にプロジェクトが進んでいる状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 網膜硝子体疾患患者硝子体中テネイシンC の濃度とVEGF との相関
九州大学、福岡大学においてPDR、PVRの硝子体手術時に硝子体サンプルを採取する。個人情報保護には細心の注意を払いつつ硝子体液と血液、血清を採取する。対照コントロールとして黄斑円孔(MH)や黄斑上膜(ERM)患者硝子体も採取する。ELISA法でテネイシンC、VEGF、ペリオスチンの濃度を計測し、PDR、PVRで高値を示すか否かを検討する。またVEGF、ペリオスチンとの相関を検討する。
2. テネイシンC標的核酸のデザインと最適化
テネイシンC 遺伝子内の異なる部位を標的として10 種類程度のsiRNA をデザインする。配列を選択する際には、各塩基のエネルギーバランス、GC 含有量、Tm 値や他の遺伝子とのホモロジーがないことなどを考慮する。次に、作製したsiRNA を培養ヒトRPE 細胞へ導入24 時間後にTGFβ 刺激によりテネイシンC 遺伝子発現を誘導し、RT-PCR により各siRNA のテネイシンC 遺伝子発現抑制効果を定量する。対照としてスクランブル配列(作製ずみ)を導入したアッセイも行う。最も良好な抑制効果が得られたテネイシンC siRNA 配列に基づいて、最適化テネイシンC nkRNA を作成する。
3. テネイシンC 標的nkRNA の網脈絡膜線維血管増殖の抑制効果の検討
①に準じて、In vitro アッセイ系での最適化テネイシンC nkRNA の細胞増殖能、遊走能、接着能、管腔形成の抑制効果の評価、In vivo OIR、CNV モデルでのnkRNA のテネイシンC 発現抑制効果および線維血管増殖組織抑制効果の評価を順次行う。また、テネイシンC nkRNA とペリオスチンnkRNA や抗VEGF 抗体の同時投与による増殖抑制の増強効果についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ペリオスチンの網脈絡膜線維血管増殖の分子機序解明解析が想定以上に順調に進み、動物飼育費、試薬代などが当初予想より少なめにすんだため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
テネイシンCの網脈絡膜線維血管増殖の分子機序解明における細胞培養実験、動物飼育費用などにあてる。また、研究進行を加速するためにテクニカルスタッフを1名雇用する。研究成果を積極的に学会発表し、論文投稿を行う。
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