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生物学的窒素固定を触媒するニトロゲナーゼの活性は酸素により強く阻害されるために、非共生窒素固定細菌である光合成細菌の窒素固定を空気中の窒素を基質として持続的に行わせるために枯草菌との共培養を検討した。
共培養における窒素固定を裏付けるためにニトロゲナーゼをコードするnif遺伝子の発現量を、共培養菌体から抽出したRNAを鋳型とした逆転写反応後のリアルタイムPCRにより測定した。その結果、塩化アンモニウムを添加して培養した光合成細菌の発現量と比較し、共培養時には発現量が大幅に増加することが明らかになった。さらにアセチレン還元法にて、無機態および有機態窒素の非存在下で得られた培養液のニトロゲナーゼ活性を測定したところ、共培養液についてのみ活性が認められた。また、培地と菌体を含む培養液から凍結乾燥により水分を除き、得られた乾燥物のC/Nを元素分析により求めた。その結果、純粋培養と比較し共培養では有意なC量の減少とN量の増加が認められた。培地に含まれる有機酸が細菌の増殖により二酸化炭素に変換され気相に移行したことでC量が減少し、封入した空気中の窒素が窒素固定により窒素化合物として菌体および培地に移行したことでN量が増加したことが推察された。
また、共培養液中の光合成細菌と枯草菌の栄養細胞数の変化を、共培養菌体から抽出したDNAを鋳型としてそれぞれの細菌が特異的に有するnifHとywsCの遺伝子量をリアルタイムPCRで定量することで調べた。この結果から、培養初期では枯草菌が活発に増殖し、培養中期では光合成細菌の増殖が顕著になり一方枯草菌は栄養細胞から芽胞形成に向かうことが示された。培養後期では光合成細菌も細胞数が減衰していくことが示された。これらの結果から、培養初期における枯草菌の増殖とそれに伴う酸素消費が共培養菌体の窒素固定活性の発現には重要な役割を果たすことが示された。
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