クライオパイリン関連周期熱症候群の発症機序の構造生物学的解明

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26461576
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 大西 秀典 岐阜大学, 医学部附属病院, 講師 (60381620)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 自己炎症性疾患 / 自然免疫

研究実績の概要

本研究では、クライオパイリン関連周期熱症候群(CAPS)発症機序の分子生物学的な解明を一義的な目的とする。特にヒトCAPS患者で同定されるNLRP3の遺伝子変異は、その遺伝子型に応じてCAPSが発症した際の重症度をおおまかに規定しているとされる。これらの分子基盤の解明のため、NLRP3リコンビナント蛋白(野生型・変異型)の発現・精製を本研究の第一の目的とした。H26年度は、NLRP3分子のリコンビナント蛋白の発現系を、昆虫細胞発現系を利用して構築することを試みた。pFastBac1にNLRP3全長及び3種類のLRRドメイン欠失型の遺伝子コンストラクトを組み込んだものを作成し、それぞれSF9細胞で蛋白発現が確認された。しかし非常に少量の蛋白しか発現せず、かつ不溶性であった。次いで、カイコを使用した蛋白発現系を利用して上記蛋白群の発現精製を試みたが、カイコ脂肪組織中からNLRP3蛋白を抽出することができなかった。NLRP3と相同性の高い分子であるNLRC4の蛋白立体構造が2014年に報告されているが、NLRC4蛋白発現はN末端のPyrinドメインを欠失させたコンストラクト(ΔPYD)で作成されていた。この情報を元にH27年度は発現コンストラクトの最適化を目的とし、NLRP3ΔPYDのコンストラクトを3種類設計し、SF9細胞に感染させ、蛋白発現を試みた。NLRP3ΔPYDはいずれもSF9細胞内に発現が確認されたが、やはり不溶性で機能実験、構造解析に使用可能な可溶性蛋白としては回収が困難であった。H28年度は、可溶性ドメイン分子(human SUMO3 tag)を融合した形のコンストラクトを作成し、蛋白発現系を再構築したが、NLRP3は分解してしまい蛋白発現を得ることはできなかった。NLRP3をリコンビナント蛋白として大量精製するのは困難である。

研究成果

• [雑誌論文] A Japanese family case with juvenile onset Behcet's disease caused by TNFAIP3 mutation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi H, Kawamoto N, Seishima M, Ohara O, Fukao T.
  • 雑誌名: Allergol Int. 巻: 66 ページ: 146-148
  • DOI: doi: 10.1016/j.alit.2016.06.006.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Pyoderma Gangrenosum, Acne and Suppurative Hidradenitis Syndrome Treated with Granulocyte and Monocyte Adsorption Apheresis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Mizutani Y, Okano T, Takahashi T, Ohnishi H, Ohara O, Sano A, Seishima M.
  • 雑誌名: Acta Derm Venereol. 巻: － ページ: －
  • DOI: doi: 10.2340/00015555-2507.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Selective Labeling of Proteins on Living Cell Membranes Using Fluorescent Nanodiamond Probes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sotoma S, Iimura J, Igarashi R, Hirosawa KM, Ohnishi H, Mizukami S, Kikuchi K, Fujiwara TK, Shirakawa M, Tochio H.
  • 雑誌名: Nanomaterials 巻: 6 ページ: 56
  • DOI: doi: 10.3390/nano6040056.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Alanine-scanning mutagenesis of human signal transducer and activator of transcription 1 to estimate loss- or gain-of-function variants (2016)
  • 著者名/発表者名: Kagawa R, Fujiki R, Tsumura M, Sakata S, Nishimura S,Itan Y, Kong XF, Kato Z, Ohnishi H, Hirata O, Saito S, Ikeda M,Baghdadi JE, Bousfiha A, Fujiwara K, Oleastro M, Yancoski J,Perez L, Danielian S, Ailal F, Takada H, Hara T, Anne Puel A, Boisson-Dupuis S, Bustamante J, Casanova JL, Ohara O, Okada S, Masao Kobayashi M.
  • 雑誌名: J Allergy Clin Immunol. 巻: － ページ: －
  • DOI: doi: 10.1016/j.jaci.2016.09.035.
  • 査読あり / 国際共著
• [産業財産権] インターロイキン-18活性阻害剤 (2016)
  • 発明者名: 大西秀典、木村豪、加藤善一郎、杤尾豪人、堤尚孝、横田歩
  • 権利者名: 京都大学、岐阜大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2015-242091
  • 出願年月日: 2016-12-09
  • 外国