| 研究課題/領域番号 |
26500003
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
三浦 豊 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10219595)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 難吸収性食品因子 / 小腸上皮 / スフィンゴミエリン / アスパラチン / エキソソーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究は体内に吸収されにくい食品因子がどのような機構で、その作用を及ぼしているかを明らかにすることを主たる目的としている。今年度は当初計画していた食品因子の一つであり、抗炎症作用を有するスフィンゴミエリンの作用について主として検討を行った。小腸上皮細胞モデルとしてはCaco-2細胞を用いた。スフィンゴミエリンが小腸上皮細胞にどのような影響を及ぼすかを明らかにするため、Caco-2細胞をカルチャーインサート上で培養し、上皮細胞様に分化させ、Apical側にミセル化したスフィンゴミエリンを添加し、膜電位の変化、蛍光物質の透過性への影響を検討したところ、添加するスフィンゴミエリンの濃度依存的に、膜電位が低下し、蛍光物質の透過性も低下することが明らかとなった。さらにApical側に、マクロファージを刺激し炎症を惹起する作用を有するLPSを添加し、Basolateral側でマクロファージ様細胞RAW264.7を培養した状態で、スフィンゴミエリンを添加したところ、RAW264.7の活性化が抑制される可能性を見出した。この結果は、スフィンゴミエリンが小腸上皮の透過性を低下させ、腸管内からの炎症性シグナルの伝達を抑制することで、炎症抑制作用を発揮している可能性を示唆している。現在、この現象のメカニズムを明らかにするため、スフィンゴミエリンを添加した際の馴らし培地を、別のCaco-2に添加することで透過性が変化するかを検討しており、変化が見られた際には培地中のエキソソームの分析を実施する予定である。もう一つの食品因子であるアスパラチンについては培地中のアスパラチン濃度の測定法の検討を実施したが、Caco-2細胞を用いた検討はまだ実施できていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では水溶性食品因子として抗糖尿病作用を有するアスパラチンを、脂溶性食品因子として抗炎症作用を有するスフィンゴミエリンを、それぞれ用いて検討することとしていた。今年度はスフィンゴミエリンを中心に検討を進めたため、アスパラチンの作用とその機構に関する検討が十分に進められていない。これは培地中のアスパラチン濃度の定量法の確立に時間がかかったためである。また、スフィンゴミエリン添加後の馴らし培地の作用を検討するところまでは進められたが、エキソソームを分離し、その構成成分を分析するところまで進めることはできなかった。この理由は、Caco-2細胞の分化状態を確認する手法の確立に時間を要したこと、Caco-2細胞を安定して上皮様細胞に分化させることに手間取ったことなど、Caco-2細胞モデルの確立に予想以上の時間を要したためである。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度はスフィンゴミエリンの膜透過性低下作用の詳細を分子レベルで明らかにすることを最初の目的とする。そのため、スフィンゴミエリン添加時のCaco-2細胞におけるタイトジャンクション構成タンパク質（オクルーディン、クローディンなど）の発現変化を検討する。またスフィンゴミエリン添加後の馴らし培地の作用を詳細に検討し、Apical側およびBasolateral側に分泌されたエキソソームがどのような成分で構成されており、どのような生理作用を有しているかを当初の計画に従って、検討していく。
一方、アスパラチンについては、その測定方法が確立したため、アスパラチンを添加した際の小腸上皮細胞の透過性への影響、またアスパラチン自身がどの程度透過するかを検討することから研究を進める計画である。こちらについてもアスパラチンが上皮細胞に作用することが明らかとなった時点で、その機構解析や分泌されるエキソソームの解析を開始する計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
上述のように主としてアスパラチンに関する検討が遅れたことにより約30万円弱の繰越額が発生している。またエキソソームの解析を行う段階まで進められなかったことも繰り越しが発生した理由である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
この次年度の使用額に関しては、次年度の検討で使用する予定であり、当初の予定通りエキソソームの分離用試薬、その成分の分析のための試薬（RNA分離、定量、エキソソームタンパク質の定量）等に使用することを計画している。
またアスパラチンの作用に関して検討を進める際にも、その測定に使用する試薬および液クロカラムの購入のために使用する計画である。
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