相同組換え修復開始を導くクロマチン構造変換後のpseudo転写構造形成の解明

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26701005
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 柴田 淳史 群馬大学, その他部局等, 助教 (30707633)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: DNA修復 / Homologous recombination / NHEJ / クロマチン

研究実績の概要

放射線照射(IR)によって生じるDNA損傷の中でも、DNA二本鎖切断(DSB)は最も重篤な損傷であり、その修復の成否は細胞の生死を決める。DSBに対する修復経路はnon-hommologous end joining(NHEJ)及びhomologous recombination(HR)の２つがある。NHEJは簡略化された分子機構とそれに伴う素早い修復速度で迅速にDSBを修復する。一方でHRは姉妹染色分体必要であるためS/G2期のみで機能する。HR最大の利点はその正確な修復反応機構である。これまでの申請者らの研究から、ヒトS/G2期細胞においてIR後に用いられる主要経路はNHEJであり、HRはマイナー経路である事が分かっている。また、NHEJがDSB修復の第一選択であり、NHEJからHRへの移行、つまりHR開始点が両修復経路決定の運命を担う分岐点である事が分かってきた。本研究ではHR開始に関わる新規DNA-end resection因子を探索し、HR開始点における新モデルを提案する。またHR開始点で必要と考えられるクロマチン構造変化を導く分子を同定することで、HR開始に必要なゲノム構造変換とその分子機構を明らかにする。siRNAライブラリー及びIP-MSを用いた別々の方法により、合計５つの新規HR候補因子が見出された。これらの因子をsiRNAによりノックダウンした細胞ではRPAのリン酸化だけではなく、RAD51 foci形成の減少及びHR頻度の低下が認められた。また発見された中の因子の一つは、DSB依存的に翻訳後修飾を受け、その修飾は転写阻害剤により抑制されたことから、DSBと転写が連携しながらresectionを進行させていることが示唆された。現在はCRISPR/Cas9システムによりノックアウト細胞を作成し解析を進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

HRに関わる新規候補遺伝子を発見しているが、これらの分子間ネットワークを繋ぐ相互作用因子または翻訳後修飾が見つかっていない。また、これらの分子はDSB部位への集積量がおそらく少ないため、従来のDSB修復分子のようにfociを形成しない。そのため、転写構造と共役するDSBを部位特異的に発生させるアッセイ系を構築する方針に変えて実験を行っているため、当初の計画よりやや遅れている。

今後の研究の推進方策

新規因子の一つは、DSB依存的に翻訳後修飾を受け、その修飾は転写阻害剤により抑制された。最終年度は、候補分子５つの中から特に上記修飾分子に注力して実験を行う。また転写構造と共役するDSBを部位特異的に発生させるアッセイ系を構築することで、新規HR因子のDSB部位への制御機構を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

本研究ではDNA修復の主要経路の１つである相同組換え修復経路の開始に関わる分子機構の解明を目指している。本事業により新規修復因子を同定し、その機能解析を行っている。これら分子のDSB部位への集積を解析するための新たなアッセイ系の構築が必要となり、次年度使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

1年間の延長により、研究成果の再現、学会発表、さらに論文の掲載などの本研究計画目標を達成したいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon and cisplatin. (2017)
  • 著者名/発表者名: Daijiro Kobayashi, Takahiro Oike, Atsushi Shibata, Atsuko Niimi, Yoshiki Kubota, Makoto Sakai, Napapat Amornwhichet, Yuya Yoshimoto, Yoshihiko Hagiwara, Yuka Kimura, Yuka Hirota, Hiro Sato, Mayu Isono, Yukari Yoshida, Takashi Kohno, Tatsuya Ohno and Takashi Nakano.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 40588
  • DOI: 10.1038/srep40588
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Regulation of pairing between broken DNA-containing chromatin regions by Ku80, DNA-PKcs, ATM, and 53BP1. (2017)
  • 著者名/発表者名: Motohiro Yamauchi, Atsushi Shibata, Keiji Suzuki, Masatoshi Suzuki, Atsuko Niimi, Hisayoshi Kondo, Miwa Miura, Miyako Hirakawa, Keiko Tsujita, Shunichi Yamashita, Naoki Matsuda.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 41812
  • DOI: 10.1038/srep41812
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] DNA Double-Strand Break Resection Occurs during Non-homologous End Joining in G1 but Is Distinct from Resection during Homologous Recombination. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ronja Biehs, Monika Steinlage, Olivia Barton, Szilvia Juhasz, Julia Kunzel, Julian Spies, Atsushi Shibata, Penny Jeggo and Markus Lobrich.
  • 雑誌名: MOLECULAR CELL 巻: 65(4) ページ: 671-684.e5
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2016.12.016
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mayu Isono, Atsuko Niimi, Takahiro Oike, Yoshihiko Hagiwara, Hiro Sato, Ryota Sekine, Yukari Yoshida, Shin-Ya Isobe, Chikashi Obuse, Ryotaro Nishi, Elena Petricci, Shinichiro Nakada, Takashi Nakano and Atsushi Shibata.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 18(2) ページ: 520-532
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2016.12.042
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of DNA double strand breaks at chromosome boundaries along the track of particle irradiation. (2016)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Niimi, Motohiro Yamauchi, Siripan Limsirichaikul, Ryota Sekine, Takahiro Oike, Hiro Sato, Keiji Suzuki, Kathryn D. Held, Takashi Nakano, and Atsushi Shibata
  • 雑誌名: GENES CHROMOSOMES & CANCER 巻: 55(8) ページ: 650-660
  • DOI: 10.1002/gcc.22367
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] DNA repair pathway regulates PD-L1 expression in cancer cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: International Symposium on Immune Diversity and Cancer Therapy Kobe 2017
  • 発表場所: 神戸ポートピアホテル(兵庫県・神戸市)
  • 年月日: 2017-01-26 – 2017-01-28
  • 国際学会
• [学会発表] DNA二本鎖切断修復経路の選択性を担う時空間的制御機構. (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] 重粒子線特異的なDNA 損傷の可視化と修復経路への影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 放射線医学総合研究の第２回放射線がん生物研究セミナー
  • 発表場所: 放射線医学総合研究所(千葉県・千葉市)
  • 年月日: 2016-11-15
  • 招待講演
• [学会発表] シンポジウム「多彩な細胞応答を制御する DNA 修復研究の最先端」（座長） (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 日本放射線影響学会第59回大会
  • 発表場所: ＪＭＳアステールプラザ(広島県・広島市)
  • 年月日: 2016-10-26 – 2016-10-28
• [学会発表] DNA 二本鎖切断修復経路を制御するDNA end resection の多段階調 (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 遺伝研研究集会「生物ゲノム安定維持の分子機構」
  • 発表場所: 国立遺伝学研究所(静岡県・三島市)
  • 年月日: 2016-10-24 – 2016-10-25
  • 招待講演
• [学会発表] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: The 32th International Symposium “Growing Edge of Radiation Biology, from principles to applications”
  • 発表場所: ホテルコープイン京都(京都府・京都市)
  • 年月日: 2016-09-01 – 2016-09-02
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation. (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: Abcam Conference “Mechanisms of Recombination”,
  • 発表場所: アリカンテ(スペイン)
  • 年月日: 2016-05-19 – 2016-05-23
  • 国際学会
• [備考] DNA修復研究 柴田研究室
  • URL: http://shibatalab.com/
• [備考] SHIBATA LAB
  • URL: http://shibatalab.com/english/