研究課題
本研究では、H3K9ヒストンメチル化酵素であるG9aとESETによる骨芽細胞分化制御の仕組みの一端を明らかにすることを目指している。平成26年度は、293細胞と10T1/2細胞にてRunx2 promoter-LucやOsteocalcin promoter-Lucを用いたレポーターアッセイをおこない、G9aとESETがRunx2の転写活性化能を増強する可能性を明らかにした。平成27年度は、in vitroで作出したG9a欠損骨芽細胞の遺伝子発現解析をおこない、G9a欠損により内在性Runx2の転写活性化能が抑制される事を明らかにした。さらに、Flag:G9aとHA:Runx2をco-transfectionした293細胞の核分画から抗Flag抗体による免疫沈降実験をおこない、Flag:G9aとHA:Runx2が結合する事を明らかにした。すでにG9aは他の転写制御因子と結合する事、結合パートナーによって必要なドメインが異なる事が明らかになりつつあった。そこで今年度は、Runx2とG9aの結合および転写活性化能増強に必要な機能ドメインを同定するべく複数のG9a部分欠損（G9a mutant）プラスミドを作成した。293細胞と10T1/2細胞にてOsteocalcin promoter-Luc、Runx2、G9a mutantを用いたレポーターアッセイをおこなったところ、Runx2の転写活性化能の増強に必要なG9aのドメインを絞り込む事ができた。また、骨芽細胞分化誘導培地で培養した10T1/2細胞の核分画を用いて抗Runx2抗体による免疫沈降実験をおこなったところ、内在性のRunx2とG9aも結合する事が示唆された。
2: おおむね順調に進展している
Runx2の転写活性化能の増強に必要なG9aのドメインの絞り込みを進めるにあたり、当初はG9aにFlag-tagを付加したコンストラクトを用いて実験を進めていた。しかし、Runx2がFlag部位と結合している事が示唆される結果が得られたため、6xMyc-tagに変更したコンストラクトを用いたところ、Runx2の転写活性化能の増強に必要なG9aのドメインを絞り込む事ができた。また、内在性のRunx2とG9aの結合が認められた事から、in vivoでもG9aがRunx2と複合体を形成してその転写活性化に寄与する可能性が示唆された。
これまでに得られた結果から、G9aとRunx2が協調的に転写活性化に寄与する可能性は高いものと考えられる。現在、内在性のG9aとRunx2の複合体の機能解析を詳細におこなっており、そこで得られた結果も含めて発表する事を目指す。
内在性のG9aとRunx2の複合体の解析を詳細に実施した後に改めて発表する事を目指したため次年度使用額が生じた。
論文校正等に使用する予定である。
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