| 研究課題/領域番号 |
60430027
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
廣海 啓太郎 京都大学, 農学部, 教授 (50025425)
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| 研究分担者 |
赤坂 一之 京都大学, 理学部, 助教授 (50025368)
中谷 博 京都大学, 農学部, 助手 (00026577)
大西 正健 京都大学, 農学部, 助手 (90026576)
外村 辨一郎 京都大学, 農学部, 助教授 (20026545)
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| キーワード | プロテアーゼ / アミノアシルtRNA合成酵素 / アミラーゼ / プロテアーゼインヒビター / 酵素ー基質相互作用 / 蛍光滴定 / ストップトフロー / 核磁気共鳴 |
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| 研究概要 |
1.中等度好熱菌B.stearothermophilusのリジルーtRNA合成酵素について、基質Lーリジン及びその類縁物との相互作用の際に観測される蛋白質蛍光の変化の挙動に対するATP共存の影響を解析し、その結果を本酵素のATPーppi交換反応に対するこれら化合物の影響と比較した。ATPが共存することにより本酵素の基質アミノ酸α側鎖の認識精度が大きく向上することが明らかとなった。2.放線菌の産生する蛋白性プロテアーゼインヒビターであるStreptomyces Subtilisin inhibitor(SSI)の酵素との反応部位近傍のアミノ酸残基を遺伝子工学的手法により置換した人工変異SSI並びに反応部位ペプチド結合(Met73ーVal174)のみを特異的に切断した修飾SSIの酵素ズブチリシンBPN′に対する阻害物質定数を精密に測定し、蛋白質分子間の特異的認識に対する界面構造の変化の影響を解析した。3.グルコアミラーゼとマルトース、イソマルトース、グルコース、グルコノラクトンとの相互作用を平衡論的に観測し、その機構を解析して各糖質が結合するサブサイトを予測した。また、pH8においてストップトフローNBS修飾を試みたところ、他の手法では観測し得なかった微小な立体構造変化を捉えることができた。4.細菌液化型αーアミラーゼをpHジャンプ並びに尿素等でその立体構造を変化させることにより、構造と触媒活性との相関を検討した結果、活性部位とは異なるところに崩れ易い構造の存在することが示唆された。5.SSIのサブユニット当り3個のメチオニンのメチルプロトンを重水素で置換し、溶液並びに固体について重水素NMRを観測した。その結果、3個のメチオニンのうち1個は内部運動を持たないが、他の2個はその側鎖が10の10乗分の1秒の相関時間を持つ速い内部運動(ゆらぎ)を行っていることが知られた。
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