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1.放線菌-大腸菌シャトルコスミドの構築
1)入ファージDNAのcohesive領域(ca.0.35Kb)をPst【I】で切り出し、Pst【I】で切断した大腸菌プラスミドpUR222(アンピシリン耐性遺伝子を含む)に連結させてコスミドを作成した(pUR222:cos)。
2)上記のコスミドをPst【I】で部分消化した後、Pst【I】で切断した多コピープラスミドpIJ703(チオストレプトン耐性、メラニン形成)と連合させシャトルコスミド1(8.83Kb)とした。同様に上記コスミドをSal【I】で切断した後、放線菌単コピープラスミド【SCP2^*】の複製領域を含むXhoI-Sal【I】断片と連結し、さらにBamH【I】で切断した後、放線菌より得たチオストレプトン耐性遺伝子のBgl【II】-BamH【I】断片を連結させ、シャトルコスミド2(9.98Kb)とした。
2.得られたシャトルコスミドの外来DNAとの連結反応及び形質導入条件の検討
シャトルコスミド1と2をそれぞれBgl【II】あるいはBamH【I】で切断後、Sau3Aで部分消化した放線菌染色体DNA(20〜40Kb)と3:1〜1:1の混合比で連結させin vitue パッケージングを行い大腸菌を形質導入した。なおパッケージング系は自家調製のものを用いて行い、市販のものと同程度の結果を得た。その結果、およそ【10^4】形質導入体1μg染色体DNAの効率で形質導入体を得ることができた。得られた組み換えプラスミドは、大腸菌内ではコピー数が幾分減少したが脱落は観察されなかった。この形質導入体より分離した組み換えプラスミドはS.lividonsにおよそ【10^5】〜【10^6】形質転換体1μgプラスミドの効率で導入することができた。今後、上記シャトルコスミドを用いて、マクロライド抗生物質及びイソクロマンキノン抗生物質生産菌の遺伝子ライブラリーを作成する予定である。
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