ギャップ結合細胞間連絡のモノクローナル抗体法による生理学的意義の解明

1988 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 62440022
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 菅野 義信 広島大学, 歯学部, 教授 (00034158)
• 研究分担者: 廣野 力 広島大学, 歯学部, 助手 (10199135) ; 佐々木 康人 広島大学, 歯学部, 助手 (50136090) ; 柴 芳樹 広島大学, 歯学部, 助教授 (90110452)
• キーワード: ギャップ結合 / 細胞間連絡 / ラット肝臓 / モノクローナル抗体 / 唾液腺細胞 / Cキナーゼ / 細胞増殖 / 細胞分化

研究概要

本年度の研究実施計画に従い、ギャップ結合蛋白質に対するモノクローナル抗体の作成と抗体の特異性の評価及びギャップ結合蛋白質の臓器特異性について調べ、以下の如き実積をあげた。
1. ラット肝臓細胞膜の20mM水酸化ナトリウム不溶性分画をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動する事により、ギャップ結合蛋白質と考えられる分子量27Kの蛋白質をある程度多量に分離精製する事ができた。通法に従って27K蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させた。HAT培地でハイブリドーマのみを増殖させ、このハイブリドーマの中から酵素免疫測定法で抗体産生細胞を選別した。限界希釈法により抗体産生細胞をクローニングし、酵素免疫測定法で27K蛋白質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を検策して数多くのモノクローナル抗体産生株を確立しつつある。
2. 確立したハイブリドーマの産出する抗体は27K蛋白質及びその二量体と考えられる約55Kの蛋白質に特異的に結合することがイムノブロット法で示された。この抗体の細胞間連絡阻害能や組織染色性を調べるために抗体の分離・精製を行いつつある。現在のところ、得た抗体はIgMで、さらに異なるタイプのモノクローナル抗体を得るために、ハイブリドーマの検策を行っている。
3. ギャップ結合蛋白質の臓器特異性を明らかにするために、上述の方法で作製した肝臓の27K蛋白質に対するモノクローナル抗体と唾液腺や培養細胞等の反応性をイムノブロット法と抗体の細胞内注入により調べている。抗体注入前のラット顎下腺房細胞の細胞間連絡はアセチルコリンのムスカリン作用とアドレナリンのαー作用によって低下した。この反応は細胞外からのCa^<2+>の流入とCキナーゼの活性化を介していると推定されている。現在、抗体注入後の腺房細胞の細胞間連絡を調べている。

研究成果

• [文献書誌] sasaki,yasuto: The Japanese Journal of physiology. 38. 531-543 (1988)
• [文献書誌] sasaki,yasuto: Journal of The physiological society of Japan. 50. 379-379 (1988)
• [文献書誌] Kanno,Yoshinobu: Fourth International Congress of cell Biology Abstracts. 234-234 (1988)
• [文献書誌] Sasaki,Yasuto: Cell Structure and Function. 13. 629-629 (1988)
• [文献書誌] Sasaki,Yasuto: Journal of Dental Research. 68. (1989)
• [文献書誌] Kanno,yoshinobu: Neuroscience Research,Supplement. (1989)
• [文献書誌] Kanno,Yoshinobu: "Proceedings of International symposium on Information Transduction and processing in Biological systems" Elsevier science publishers, (1989)